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公開番号2025105774
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-10
出願番号2025070853,2022520446
出願日2025-04-22,2020-10-02
発明の名称初代ヒト細胞における、同族T細胞及びエピトープ反応性をスクリーニングするハイスループット法
出願人リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド,REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/04 20060101AFI20250703BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】初代ヒト細胞における、同族T細胞及びエピトープ反応性をスクリーニングするハイスループット法の提供。
【解決手段】個体自身の血液細胞が、HLAハプロタイプ特異的試薬を用いることなく、対象となる個別の抗原、例えばT細胞エピトープに対して機能的にスクリーニングされることができる、自己由来の初代免疫細胞アッセイについて記載する。抗原反応性は、オリゴヌクレオチドタグ細分化追跡システムを用いて個別のT細胞と結びつき、反応性はその後、シングルセル配列決定により逆畳み込みされる。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
明細書に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）により、２０１９年１０月３日に出願された、米国特許仮出願番号第６２／９１０，３７９号の優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている。
続きを表示（約 3,000 文字）【０００２】
ＥＦＳＷＥＢによりテキストファイルとして提出された配列表の参照
ファイル１０６６９＿ＳＴ２５．ｔｘｔに記載する配列表は５キロバイトであり、２０２０年１０月２日に作製され、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ヒト疾患における抗原特異的Ｔ細胞活性への関心に一層焦点が当てられるようになっているため、エピトープ特異的ＴＣＲ配列を、ＨＬＡの文脈で提示される同族エピトープと相関させることができることが必要とされている。しかし、どのエピトープが、生産的なＴ細胞の活性化、及び、応答するＴ細胞のＴＣＲ配列をもたらすかを識別することは、歴史的に、技術上問題のある課題となって現在まで続いている。
【０００４】
抗原特異的Ｔ細胞結合及び反応性を評価するために使用する従来の方法としては、Ｔ細胞が、サイトカインまたは細胞溶解応答により検出されるエピトープに再曝露される、多量体染色及び機能的Ｔ細胞アッセイ（例えばＥＬＩＳＰＯＴ、細胞殺傷アッセイ）が挙げられる。これらの方法は有用である一方で、ハイスループットで反応性の可能性を評価するために、高価な個別のＨＬＡハプロタイプ特異的試薬（多量体）及び多量の血液量を必要とする可能性がある。加えて、ＨＬＡクラスＩＩ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）多量体はほとんど存在しないため、多量体に基づく調査は、ＨＬＡクラスＩ（ＣＤ８＋Ｔ細胞）反応性に焦点が当てられる。
【０００５】
したがって、とりわけ、ＴＣＲの同族ＴＣＲα及びβポリペプチドを、ＴＣＲにより認識されるエピトープと相関させる情報をもたらすことが可能なハイスループット法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
対象となる複数のＴ細胞エピトープに対するＣＤ８＋及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞が同時にアッセイ可能な、自己及び初代免疫細胞で使用可能な免疫細胞アッセイを本明細書に記載する。抗原の反応性は、ハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）追跡システムを用いて個別のＴ細胞と結びつけられ、この関連付けが、後で、シングルセル配列決定により逆畳み込みされ、（ａ）エピトープ特異性、（ｂ）シングルセルの対形成したアルファ／ベータ鎖ＴＣＲ配列、（ｃ）内因性シングルセルＲＮＡトランスクリプトーム情報、（ｄ）細胞表面タンパク質発現（例えば、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ抗体を用いる）、（ｅ）多量体染色（多量体が含まれる場合）、及びこれらの任意の組み合わせなどのシングルセルレベルの情報を提供することができる。したがって、免疫細胞アッセイ法、そのための組成物及びキット、ならびに、例えば、ＴＣＲ治療薬を作製するための、その使用を本明細書で提供する。
【０００７】
一実施形態では、本明細書に記載する方法は、例えば、活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の、活性化Ｔ細胞の発現に基づき、他の細胞、例えば自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む組成物から、活性化Ｔ細胞をソートすることであって、活性化Ｔ細胞がＨＴＯコンジュゲート分子で標識される、上記ソートすることを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する（例えば、Ｔ細胞、ならびに任意選択的に、抗原に特異的に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の、ＴＣＲα鎖配列、及び／またはＴＣＲβ鎖配列を活性化可能な前記抗原を識別するための）方法は、
（Ｉ）活性化誘発マーカー（ＡＩＭ）の発現に基づき、活性化Ｔ細胞を、固有の生体サンプルを含む組成物からソートすることであって、固有の生体サンプルが、（ａ）Ｔ細胞及び表面結合主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であって、Ｔ細胞が、表面結合ＭＨＣの文脈で提示されるペプチドを認識可能な、上記Ｔ細胞及びＭＨＣ、（ｂ）固有の抗原、（ｃ）固有の抗原を特異的に識別ために使用可能な（及び／または、特異的に識別する）固有のハッシュタグオリゴヌクレオチド（ＨＴＯ）であって、固有のＨＴＯが、Ｔ細胞を固有のＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした、上記固有のＨＴＯ、ならびに、任意選択的に、（ｄ）Ｔ細胞の活性化を支持する培地を含む、上記ソートすることと、
（ＩＩ）（Ｉ）でソートした活性化Ｔ細胞でシングルセル配列決定分析を行い、活性化Ｔ細胞を固有のＨＴＯで標識した分子にコンジュゲートした固有のＨＴＯを識別することであって、固有のＨＴＯを識別することが、活性化Ｔ細胞を活性化可能な抗原を識別し、任意選択的に、シングルセル配列決定分析が、（ｉ）活性化Ｔ細胞により発現する１つ以上の遺伝子、及び／または、（ｉｉ）活性化Ｔ細胞により発現されるＴＣＲのＴＣＲα及び／またはβ鎖配列もまた識別する、上記識別することと、
を含む。
【０００９】
本明細書に記載するいくつかの方法は、ソート工程の前に、複数の生体サンプル、例えば固有の生体サンプルを作製し、ソートした組成物が、複数の固有の生体サンプルを含むようにすることをさらに含む。いくつかの方法の実施形態は、ソートする前に、対象から単離したＴ細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞の集まりを、個別のサンプルに等しく分配することにより、複数の生体サンプルを作製する工程であって、各生体サンプルが任意選択的に、Ｔ細胞及び／またはＡＰＣ生存能、活性化及び／または活性を支持する培地及びサイトカインを含む、上記工程を含む。
【００１０】
いくつかの方法の実施形態は、ソートする前に、固有の抗原を特異的に識別するために使用可能な（及び／または、特異的に識別する）、複数の生体サンプル、単独の固有の抗原、及び／または単独の固有のＨＴＯのそれぞれを送達することにより、複数の固有の生体サンプルを作製する工程であって、固有のＨＴＯが、Ｔ細胞を固有のＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートし、複数の生体サンプルのそれぞれが、対象から単離したＴ細胞及びＡＰＣを含む細胞の集まりを含み、固有の抗原及び／またはＴ細胞を固有のＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした固有のＨＴＯの送達後、複数の生体サンプルのそれぞれが、（ａ）対象から単離したＴ細胞及びＡＰＣを含む細胞の集まり、（ｂ）固有の抗原、（ｃ）固有の抗原を特異的に識別し、Ｔ細胞をＨＴＯで標識する分子にコンジュゲートした固有のＨＴＯ、ならびに任意選択的に、（ｄ）Ｔ細胞及びＡＰＣの生存能、活性、及び／または活性化を支持する培地を含む固有の生体サンプルになる、上記工程を含む。任意選択的に、複数の固有の生体サンプルは、本明細書に記載の方法でソートする前にプールし、（Ｉ）でソートされた組成物が複数の固有の生体サンプルを含むようにすることができる。本明細書のいくつかの方法の実施形態は、ソート工程の前に、複数の生体サンプルを作製し、（例えば、複数の生体サンプルから）複数の固有の生体サンプルを作製する工程と、任意選択的に、複数の固有の生体サンプルをプールして、本明細書に記載する方法に従いソート可能な組成物を作製する工程の両方を含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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