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公開番号2025101061
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-07
出願番号2023217626
出願日2023-12-25
発明の名称TALエフェクターヌクレアーゼ対およびその利用
出願人学校法人藤田学園
代理人個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20250630BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】変異mtDNAと野生型mtDNAとのうちの一方をより特異的に切断することができる技術を提供する。
【解決手段】TALエフェクターヌクレアーゼ対は、標的配列が12塩基以上20塩基以下離れた第1のTALエフェクターヌクレアーゼモノマーと第2のTALエフェクターヌクレアーゼモノマーとを含み、それぞれ、RVDを含み8塩基以上15塩基以下のDNAに結合するDNA結合ドメインと、FokIエンドヌクレアーゼのDNA切断ドメインとを有し、RVDは、ミトコンドリア病誘発変異の位置の塩基を認識する第1のRVDと、ミトコンドリア病誘発変異の位置以外の塩基を認識する第2のRVDと、を含み、第1のRVDは、アデニンを認識するNMと、グアニンを認識するWKと、グアニンを認識するLKと、のうちの少なくとも1つであり、第2のRVDは、NIによってアデニンを認識し、NNによってグアニンを認識する。
【選択図】図6

特許請求の範囲【請求項１】
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対であって、
第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーと、第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーと、を含み、
前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーの標的配列と前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーの標的配列とは、１２塩基以上２０塩基以下離れており、
前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーと前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーとは、それぞれ、
ＲＶＤを含み、８塩基以上１５塩基以下のＤＮＡに結合するＤＮＡ結合ドメインと、
ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインと、
を有し、
前記ＲＶＤは、
ミトコンドリア病誘発変異の位置の塩基を認識する第１のＲＶＤと、
前記ミトコンドリア病誘発変異の位置以外の塩基を認識する第２のＲＶＤと、を含み、
前記第１のＲＶＤは、アデニンを認識するＮＭと、グアニンを認識するＷＫと、グアニンを認識するＬＫと、のうちの少なくとも１つであり、
前記第２のＲＶＤは、ＮＩによってアデニンを認識し、ＮＮによってグアニンを認識する、
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対。
続きを表示（約 2,100 文字）【請求項２】
請求項１に記載のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対において、
前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーと前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーとがそれぞれ有する前記ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインは、互いに異なるアミノ酸配列を有し、ヘテロ二量体を形成する、
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対。
【請求項３】
請求項１に記載のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対において、
変異ミトコンドリアＤＮＡに結合する、
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対。
【請求項４】
請求項１に記載のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対において、
野生型ミトコンドリアＤＮＡに結合する、
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対。
【請求項５】
請求項１に記載のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対において、
前記ミトコンドリア病誘発変異が、Ａ３２４３Ｇ変異である、
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対。
【請求項６】
請求項５に記載のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対において、
前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーにおける前記ＲＶＤは、
ＮＮ－ＮＮ－ＨＤ－ＮＩ－ＮＮ－ＷＫ－ＮＮ－ＨＤ―ＨＤ－ＨＤ－ＮＮと、
ＮＮ－ＮＮ－ＨＤ－ＮＩ－ＮＮ－ＬＫ－ＮＮ－ＨＤ―ＨＤ－ＨＤ－ＮＮと、
ＮＮ－ＮＮ－ＨＤ－ＮＩ－ＮＮ－ＮＭ－ＮＮ－ＨＤ―ＨＤ－ＨＤ－ＮＮと、
のうちのいずれか１つである、
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対。
【請求項７】
請求項５に記載のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対において、
前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーにおける前記ＲＶＤは、
ＮＩ－ＮＩ－ＮＩ－ＮＮ－ＮＧ－ＮＧ－ＮＧ－ＮＧ―ＮＩ－ＮＩ－ＮＮ－ＮＧと、
ＮＩ－ＮＩ－ＮＩ－ＮＮ－ＮＧ－ＮＧ－ＮＧ－ＮＧ―ＮＩ－ＮＩ－ＮＮと、
ＮＮ－ＮＧ－ＮＩ－ＮＩ－ＮＩ－ＮＮ－ＮＧ－ＮＧ－ＮＧ－ＮＧ―ＮＩ－ＮＩ－ＮＮ－ＮＧと、
のうちのいずれか１つである、
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対。
【請求項８】
請求項５に記載のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対において、
前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーは、
配列番号１から配列番号３までのいずれか１つで示されるアミノ酸配列と、
配列番号１から配列番号３までのいずれか１つで示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列と、
配列番号１から配列番号３までのいずれか１つで示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列と、
のうちのいずれか１つであり、
前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーは、
配列番号４、配列番号１９、配列番号２０のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列と、
配列番号４、配列番号１９、配列番号２０のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列と、
配列番号４、配列番号１９、配列番号２０のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列と、
のうちのいずれか１つである、
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対。
【請求項９】
第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第１の核酸と、第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第２の核酸と、を含み、
前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーの標的配列と前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーの標的配列とは、１２塩基以上２０塩基以下離れており、
前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーと前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーとは、それぞれ、
ＲＶＤを含み、８塩基以上１５塩基以下のＤＮＡに結合するＤＮＡ結合ドメインと、
ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインと、
を有し、
前記ＲＶＤは、
ミトコンドリア病誘発変異の位置の塩基を認識する第１のＲＶＤと、
ミトコンドリア病誘発変異の位置以外の塩基を認識する第２のＲＶＤと、を含み、
前記第１のＲＶＤは、アデニンを認識するＮＭと、グアニンを認識するＷＫと、グアニンを認識するＬＫと、のうちの少なくとも１つであり、
前記第２のＲＶＤは、ＮＩによってアデニンを認識し、ＮＮによってグアニンを認識する、
核酸組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸組成物を含む、
ベクター。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対に関する。
続きを表示（約 2,100 文字）【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアの働きが低下することで発症するミトコンドリア病の一部は、ミトコンドリアが有するミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の変異が原因であることが知られている。ｍｔＤＮＡは、一つの細胞の中に数百から数千コピー存在している。多くの場合において、変異ｍｔＤＮＡは、正常である野生型ｍｔＤＮＡと混在しており、変異ｍｔＤＮＡの割合が一定以上になると機能障害を引き起こすと考えられている。変異ｍｔＤＮＡと野生型ｍｔＤＮＡとが共存する状態（ヘテロプラスミー）において、一方のｍｔＤＮＡに二本鎖切断を導入すると、切断されたｍｔＤＮＡが消失して、変異ｍｔＤＮＡと野生型ｍｔＤＮＡとの割合を改変できることが知られている。Transcription activator-like effector nuclease（ＴＡＬＥＮ）を含むゲノム編集技術は、配列特異的にＤＮＡの二本鎖切断を導入することができる。このため、変異ｍｔＤＮＡまたは野生型ｍｔＤＮＡを特異的に切断するＴＡＬＥＮを設計することで、変異ｍｔＤＮＡと野生型ｍｔＤＮＡとの割合を変えることが可能になる（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
特開２０１８－１３９５８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ｍｔＤＮＡ変異が原因のミトコンドリア病の病態は、複雑であり、根本的治療法がない状況である。ｍｔＤＮＡの変異比率を改変する技術は、病態の再現に利用することができ、病態の解明や治療法の開発への利用が期待される。また、変異ｍｔＤＮＡの割合を減ずることができれば、病気の原因の根本治療法として利用できる可能性がある。このため、変異ｍｔＤＮＡと野生型ｍｔＤＮＡとのうちの一方を、より特異的に切断することができる技術が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、以下の形態として実現することが可能である。
【０００６】
（１）本開示の一形態によれば、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対が提供される。このＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対は、第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーと、第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーと、を含み、前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーの標的配列と前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーの標的配列とは、１２塩基以上２０塩基以下離れており、前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーと前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーとは、それぞれ、ＲＶＤを含み、８塩基以上１５塩基以下のＤＮＡに結合するＤＮＡ結合ドメインと、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインと、を有し、前記ＲＶＤは、ミトコンドリア病誘発変異の位置の塩基を認識する第１のＲＶＤと、前記ミトコンドリア病誘発変異の位置以外の塩基を認識する第２のＲＶＤと、を含み、前記第１のＲＶＤは、アデニンを認識するＮＭと、グアニンを認識するＷＫと、グアニンを認識するＬＫと、のうちの少なくとも１つであり、前記第２のＲＶＤは、ＮＩによってアデニンを認識し、ＮＮによってグアニンを認識する。この形態のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対によれば、変異ｍｔＤＮＡと野生型ｍｔＤＮＡとのうちの一方を、より特異的に切断することができる。
【０００７】
（２）上記（１）に記載のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対において、前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーと前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーとがそれぞれ有する前記ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインは、互いに異なるアミノ酸配列を有し、ヘテロ二量体を形成してもよい。この形態のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対によれば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼがヘテロ二量体を形成するので、変異ｍｔＤＮＡと野生型ｍｔＤＮＡとのうちの一方を、さらに特異的に切断することができる。
【０００８】
（３）上記（１）または上記（２）に記載のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対において、変異ミトコンドリアＤＮＡに結合してもよい。この形態のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対によれば、変異ｍｔＤＮＡを特異的に切断することができる。
【０００９】
（４）上記（１）または上記（２）に記載のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対において、野生型ミトコンドリアＤＮＡに結合してもよい。この形態のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対によれば、野生型ｍｔＤＮＡを特異的に切断することができる。
【００１０】
（５）上記（１）から上記（４）までのいずれか一項に記載のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対において、前記ミトコンドリア病誘発変異が、Ａ３２４３Ｇ変異であってもよい。この形態のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対によれば、Ａ３２４３Ｇ変異に関する変異ｍｔＤＮＡと野生型ｍｔＤＮＡとのうちの一方を、特異的に切断することができる。
（【００１１】以降は省略されています）

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