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公開番号2025097098
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-30
出願番号2023213181
出願日2023-12-18
発明の名称ポリヒドロキシアルカン酸、組換え水素酸化細菌、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
出願人国立大学法人東京科学大学,帝人株式会社
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12P 7/625 20220101AFI20250623BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】安価な炭素源の存在下に、α位にメチル基を有するモノマー成分を含むPHAの製造方法を提供する。
【解決手段】重量平均分子量(Mw)が100万以上で、α位にメチル基を有するモノマー成分を含み、前記モノマー成分が3-ヒドロキシ-2-メチルプロピオン酸(3H2MP)である、ポリヒドロキシアルカン酸(PHA);3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ(hbdH)遺伝子を欠損させた、α位にメチル基を有するモノマー成分を含むPHA生産能を有する、遺伝子欠損水素酸化細菌;並びに、α位にメチル基を有するモノマー成分を含むPHAの製造方法であって、(i)PHA重合酵素を有するhbdH遺伝子欠損水素酸化細菌を作製する工程;(ii)前記遺伝子欠損水素酸化細菌を炭素源存在下に培養する工程、及び(iii)培養物から、α位にメチル基を有するモノマー成分を含むαPHAを採取する工程を含む、製造方法。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
重量平均分子量（Ｍｗ）が１００万以上である、α位にメチル基を有するモノマー成分を含むポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）であって、前記α位にメチル基を有するモノマー成分が３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸（３Ｈ２ＭＰ）である、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）。
続きを表示（約 800 文字）【請求項２】
３－ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ｈｂｄＨ）遺伝子を欠損させた、共重合ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生産能を有する遺伝子欠損水素酸化細菌であって、前記共重合ＰＨＡがα位にメチル基を有するモノマー成分を含む、遺伝子欠損水素酸化細菌。
【請求項３】
α位にメチル基を有するモノマー成分を含むポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の製造方法であって、
（ｉ）ＰＨＡ重合酵素を有する３－ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ｈｂｄＨ）遺伝子欠損水素酸化細菌を作製する工程；
（ii）前記遺伝子欠損水素酸化細菌を炭素源存在下に培養する工程、及び
（iii）培養物から、α位にメチル基を有するモノマー成分を含むＰＨＡを採取する工程
を含む、製造方法。
【請求項４】
前記工程（ｉ）が、前記遺伝子欠損水素酸化細菌に広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子を導入する工程を含む、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記炭素源が、糖及び／又は二酸化炭素である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項６】
前記二酸化炭素が、二酸化炭素を１～２０％（ｖ／ｖ）で含む混合ガスである、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記糖がフルクトースである、請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
前記工程（ii）において、α位にメチル基を有するモノマー成分の前駆体を更に添加する、請求項３に記載の製造方法。
【請求項９】
前記前駆体が、メタクリル酸及び／又は分岐アミノ酸である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記分岐アミノ酸が、バリン又はイソロイシンである、請求項９に記載の製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、α位にメチル基を有する特定のモノマー成分を含む高分子量のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）、共重合ＰＨＡ生産能を有する、特定の遺伝子を欠損ささせた水素酸化細菌、及び、α位にメチル基を有するモノマー成分を含むＰＨＡを製造する方法に関する。
続きを表示（約 3,600 文字）【背景技術】
【０００２】
３－ヒドロキシアルカン酸の重合体であるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は微生物が細胞内に蓄積するバイオポリエステルである。近年では、生分解性プラスチック素材としてのみならず、バイオマス由来のプラスチック素材として注目されている。
【０００３】
最も一般的なＰＨＡである、（Ｒ）－３－ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）を構成成分とするホモポリマー（以下、適宜、「Ｐ（３ＨＢ）」と表記）は結晶性であるため、加工時間を短縮できる一方、硬くて脆く、実用性に乏しい。また、溶融時にポリマーが低分子量化してしまうなど成型加工時の劣化が問題となり、工業生産には向いていない。この物性を改善する手段の一つとして、３ＨＢと他のモノマーとの共重合体（以下、ＰＨＡの共重合体を、適宜、「共重合ＰＨＡ」と表記）が種々開発されてきた。
【０００４】
一方、吉草酸や酪酸などのα位にメチル基を有さないモノマー成分を含むＰＨＡは、耐熱性（分解温度）が低いのに対して、３－ヒドロキシ－２－メチルブタン酸（３Ｈ２ＭＢ）や３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸（３Ｈ２ＭＰ）などの、α位にメチル基を有するモノマー成分を含むＰＨＡは、耐熱性に優れ、結晶化速度が速く、高性能な生分解性プラスチックとして使用できる。例えば、本発明者らは、炭素源と、３Ｈ２ＭＢの前駆物質（チグリン酸）との存在下に、３Ｈ２ＭＢを高分率で含む共重合ＰＨＡの合成を報告している（特許文献１）。その他、α位にメチル基を有するモノマー成分を含むＰＨＡの合成は多数報告されている（非特許文献１～５）。
【０００５】
しかしながら、当該モノマー成分を導入するためには、チグリン酸のような高価な前駆体を使用する必要があった（特許文献１、非特許文献１～５）。また、添加した前駆体の細胞毒性により菌体収量及びＰＨＡ生産量が低下するという課題があった（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
特許第７１３３１８７号明細書
【非特許文献】
【０００７】
D. O. I. Yoshiharu, K. Shiro, 1995 [Online]. Available: https://lens.org/183-171-147-994-584
Furutate S, Nakazaki H, Maejima K, Hiroe A, Abe H, Tsuge T, (2017), J. Polym. Res., 24: 221, https://doi.org/10.1007/s10965-017-1392-3
Furutate S, Abe H, Tsuge T, (2021), Polymer Journal, 53:1451-1457, https://doi.org/10.1038/s41428-021-00545-4
Furutate S, Kamoi J, Nomura C T, Taguchi S, Abe H, Tsuge T, (2021), NPG Asia Materials, 13:31, https://doi.org/10.1038/s41427-021-00296-x
Vermeer C M, Bons L J, Kleerebezem R, (2022) Appl. Microbiol. Biotechnol., 106:605-618, https://doi.org/10.1007/s00253-021-11742-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、前駆体を使用することなく、安価な炭素源の存在下に、α位にメチル基を有するモノマー成分を含むＰＨＡを製造する方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、斯かる実状に鑑み鋭意検討した結果、ＰＨＡの生合成経路において３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオニル－ＣｏＡから３－ヒドロキシバレリル－ＣｏＡ（３ＨＶ－ＣｏＡ）への反応を触媒する酵素群のうち、３－ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨｂｄＨ）をコードする遺伝子を水素酸化細菌のゲノムから欠損させた組換え水素酸化細菌を作製し、当該組換え水素酸化細菌を用いることによって、α位にメチル基を有するモノマー成分の前駆体を使用することなく、α位にメチル基を有するモノマー成分を第２成分の１つとして含むＰＨＡが効率よく得られることを見出し、本発明を完成させた。また、ＨｂｄＨをコードする遺伝子を欠損させると、高分子量のＰＨＡを与えることも見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）重量平均分子量（Ｍｗ）が１００万以上である、α位にメチル基を有するモノマー成分を含むポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）であって、前記α位にメチル基を有するモノマー成分が３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸（３Ｈ２ＭＰ）である、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）。
（２）３－ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ｈｂｄＨ）遺伝子を欠損させた、共重合ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生産能を有する遺伝子欠損水素酸化細菌であって、前記共重合ＰＨＡがα位にメチル基を有するモノマー成分を含む、遺伝子欠損水素酸化細菌。
（３）α位にメチル基を有するモノマー成分を含むポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の製造方法であって、
（ｉ）ＰＨＡ重合酵素を有する３－ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ｈｂｄＨ）遺伝子欠損水素酸化細菌を作製する工程；
（ii）前記遺伝子欠損水素酸化細菌を炭素源存在下に培養する工程、及び
（iii）培養物から、α位にメチル基を有するモノマー成分を含むＰＨＡを採取する工程
を含む、製造方法。
（４）前記工程（ｉ）が、前記遺伝子欠損水素酸化細菌に広基質特異性のＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子を導入する工程を含む、（３）に記載の製造方法。
（５）前記炭素源が、糖及び／又は二酸化炭素である、（３）又は（４）に記載の製造方法。
（６）前記二酸化炭素が、二酸化炭素を１～２０％（ｖ／ｖ）で含む混合ガスである、（５）に記載の製造方法。
（７）前記糖がフルクトースである、（５）又は（６）に記載の製造方法。
（８）前記工程（ii）において、α位にメチル基を有するモノマー成分の前駆体を更に添加する、（３）～（７）のいずれか１に記載の製造方法。
（９）前記前駆体が、メタクリル酸及び／又は分岐アミノ酸である、（８）に記載の製造方法。
（１０）前記分岐アミノ酸が、バリン又はイソロイシンである、（９）に記載の製造方法。
（１１）前記α位にメチル基を有するモノマー成分が、３－ヒドロキシ－２－メチルプロピオン酸（３Ｈ２ＭＰ）である、（３）～（１０）のいずれか１に記載の製造方法。
（１２）前記α位にメチル基を有するモノマー成分が、３－ヒドロキシ－２－メチルブタン酸（３Ｈ２ＭＢ）である、（３）～（１０）のいずれか１に記載の製造方法。
（１３）炭素源としてのフルクトースに加えて、イソロイシンを添加する、（１２）に記載の製造方法。
（１４）前記α位にメチル基を有するモノマー成分を含むＰＨＡが、３－ヒドロキシバレリル酸（３ＨＶ）をモノマー成分として実質的に含まない、（３）～（１３）のいずれか１に記載の製造方法。
（１５）前記工程（ｉ）が、２－ケト酸デカルボキシラーゼ（ｋｉｖｄ）遺伝子、及びフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｐａｄＡ）遺伝子を導入する工程を更に含む、（３）～（１４）のいずれか１に記載の製造方法。
（１６）前記工程（ｉ）が、３－ケトチオラーゼ（ｂｋｔＢ）遺伝子を導入する工程を更に含む、（３）～（１５）のいずれか１に記載の製造方法。
（１７）前記水素酸化細菌が、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）である、（３）～（１６）のいずれか１に記載の製造方法。
（１８）前記ＰＨＡ重合酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎｃａｖｉａｅ）由来のＰＨＡ重合酵素の１４９番のアスパラギンがセリンに、かつ１７１番のアスパラギン酸がグリシンに置換されたＰＨＡ重合酵素変異体をコードするものである、（４）～（１７）のいずれか１に記載の製造方法。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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