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公開番号2025090847
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-17
出願番号2025046268,2023517468
出願日2025-03-21,2022-04-20
発明の名称細胞培養基材及びその製造方法、多能性幹細胞の分化誘導方法、並びに細胞培養キット
出願人東ソー株式会社
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12M 1/00 20060101AFI20250610BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】細胞凝集塊を形成可能であるとともに、細胞凝集塊中の細胞の生存率を高くすることが可能であり、培養時の気泡除去作業を不要にする細胞培養基材及びその製造方法を提供すること。三胚葉細胞への分化誘導効率に優れる、該細胞培養基材を用いた多能性幹細胞の分化誘導方法を提供すること。
【解決手段】基材と、該基材の表面の少なくとも一部を被覆する層厚5～2000nmの親水性高分子を含有する層と、を備え、親水性高分子は、ホスホリルコリン基又は水酸基を含み、下記(A)領域及び下記(B)領域を有し、(A)領域と(B)領域の境界における凹凸高さは1～500nmである、細胞培養基材。
(A)細胞接着性及び細胞増殖性を有する島状の領域
(B)前記(A)領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
基材と、前記基材の表面の少なくとも一部を被覆する層厚５～２０００ｎｍの親水性高分子を含有する層と、を備え、
前記親水性高分子は、ホスホリルコリン基又は水酸基を含み、
下記（Ａ）領域及び下記（Ｂ）領域を有し、
前記（Ａ）領域と前記（Ｂ）領域の境界における凹凸高さは１～５００ｎｍである、細胞培養基材。
（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する島状の領域
（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域
続きを表示（約 1,500 文字）【請求項２】
前記親水性高分子が、下記一般式（１）で表される化合物、下記一般式（２）で表される化合物、又は下記一般式（３）で表される化合物を含む、請求項１に記載の細胞培養基材。
JPEG
2025090847000009.jpg
35
149
［一般式（１）中、Ｒ
１
及びＲ
２
はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示し、Ｒ
３
は水素原子又は任意の有機基を示し、ｍ及びｎはそれぞれ独立に正の整数を示す。］
JPEG
2025090847000010.jpg
36
149
［一般式（２）中、Ｒ
４
、Ｒ
５
及びＲ
６
はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示し、Ｒ
７
は水素原子又は任意の有機基を示し、ｘ、ｙ及びｚはそれぞれ独立に正の整数を示す。］
JPEG
2025090847000011.jpg
48
149
［一般式（３）中、Ｒ
８
及びＲ
９
はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示し、Ｒ
１０
は水素原子又は任意の有機基を示し、ａ及びｂはそれぞれ独立に正の整数を示す。］
【請求項３】
前記親水性高分子が、ＵＶ反応性の官能基又はＵＶ反応後の残基を有する単量体単位を含む、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
前記（Ａ）領域についてのＸＰＳ測定のＣ１ｓスペクトルにおける２８７ｅＶのピーク強度／２８５ｅＶのピーク強度の比が、前記（Ｂ）領域についてのＸＰＳ測定のＣ１ｓスペクトルにおける２８７ｅＶのピーク強度／２８５ｅＶのピーク強度の比よりも０．０５以上大きい、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項５】
前記親水性高分子を含有する層の表面に、層厚１～１００ｎｍの温度応答性高分子を含有する層を更に備え、
前記温度応答性高分子は、水不溶性ブロックセグメント及び温度応答性ブロックセグメントを含むブロック共重合体である、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項６】
前記水不溶性ブロックセグメント及び前記温度応答性ブロックセグメントの総重量に対する前記温度応答性ブロックセグメントの重量の割合が９０重量％超である、請求項５に記載の細胞培養基材。
【請求項７】
前記基材の屈折率が１．４～１．６であり、且つ、前記基材の厚みが０．０１～０．５ｍｍである、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項８】
励起波長３５０ｎｍ、４８８ｎｍ、及び６４７ｎｍでそれぞれ励起された前記基材の蛍光強度が、同じ励起波長で励起された、厚み１．２ｍｍのポリスチレン板の蛍光強度よりも小さい、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項９】
前記（Ａ）領域の面積が、０．００１～５ｍｍ
２
である、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項１０】
前記（Ａ）領域の面積が、０．００５～０．２ｍｍ
２
であり、
前記（Ａ）領域の数が、前記（Ａ）領域及び前記（Ｂ）領域の合計面積を基準として、２００～１０００個／ｃｍ
２
である、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養基材及びその製造方法、多能性幹細胞の分化誘導方法、並びに細胞培養キットに関する。
続きを表示（約 1,900 文字）【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞は、生体の様々な組織に分化する能力（分化万能性）を持つ細胞であり、再生医療分野や創薬スクリーニングのための細胞ソースとして大きな注目が寄せられている。多能性幹細胞を再生医療や創薬スクリーニングに応用するには、多能性幹細胞から目的の細胞へと分化させる必要があるが、その際、多能性幹細胞の細胞凝集塊を形成する必要がある。また、多能性幹細胞は様々な細胞へと分化することができるが、分化後の細胞の種類によって最適な細胞凝集塊のサイズが異なることが知られており、サイズを制御し、更にサイズの均一な細胞凝集塊を作成することが望ましい。
【０００３】
細胞凝集塊を形成する方法として従来、多能性幹細胞が接着しない基材を用いることで多能性幹細胞に自発的に凝集体を形成させる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この方法は細胞凝集塊の量産性に優れるものの、均一なサイズの細胞凝集塊を得ることができないという問題があった。
【０００４】
サイズの均一な細胞凝集塊を形成する方法として、表面に微細な凹凸を設けた細胞培養基材を使用する方法が知られている（例えば、特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
特開平８－１４０６７３号公報
特開２０１５－０７３５２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献２に開示されるような微細な凹凸を設けた細胞培養基材は量産性に乏しく、大量の細胞凝集塊を形成する用途には不向きであるという問題があった。また、微細な凹凸内で細胞を強制的に凝集させることから、死細胞が細胞凝集塊の中に混入しやすいという問題があった。また、微細凹凸を有する細胞培養基材に培地を接触させた際に、表面の微細凹凸に気泡が取り込まれやすく、培養を開始する前に気泡の除去作業が必要であるという課題があることを本発明者らは見出した。気泡を除去するためには通常、ピペッターを用いて培地の吸引と吐出を繰り返す必要があり、作業性に劣るという問題があった。
【０００７】
本発明の課題は、細胞凝集塊を形成可能であるとともに、細胞凝集塊中の細胞の生存率を高くすることが可能であり、培養時の気泡除去作業を不要にする細胞培養基材及びその製造方法を提供することにある。本発明の他の課題は、三胚葉細胞への分化誘導効率に優れる、該細胞培養基材を用いた多能性幹細胞の分化誘導方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、基材と、該基材の表面の少なくとも一部を被覆する層厚５～２０００ｎｍの親水性高分子を含有する層と、を備え、上記親水性高分子は、ホスホリルコリン基又は水酸基を含み、下記（Ａ）領域及び下記（Ｂ）領域を有し、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さは１～５００ｎｍである、細胞培養基材に関する。
（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ
２
の島状の領域
（Ｂ）（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域
【０００９】
本発明はまた、（１）基材の表面の少なくとも一部をＵＶ反応性の親水性高分子を含有する組成物で被覆し、親水性高分子を含有する層を形成する工程、（２）親水性高分子を含有する層にＵＶ照射を行い、親水性高分子を含有する層を基材の表面に固定化する工程、及び（３）固定化した親水性高分子を含有する層の表面の一部にプラズマ処理を行い、プラズマ処理を行った部分に（Ａ）領域を形成する工程を備える、上記細胞培養基材の製造方法に関する。
【００１０】
本発明はまた、（１’）繰り返し単位に芳香族炭化水素基を含む高分子から形成される基材を用い、上記基材の表面にプラズマ処理を行い、プラズマ処理を行った部分に上記（Ａ）領域を形成する工程、（２’）上記基材の表面の少なくとも一部をＵＶ反応性の親水性高分子を含有する組成物で被覆し、上記親水性高分子を含有する層を形成する工程、（３’）上記親水性高分子を含有する層の一部にＵＶ照射を行い、上記親水性高分子を含有する層の一部を上記基材の表面に固定化する工程、及び（４’）上記親水性高分子を溶媒で洗浄し、表面に固定化されていない親水性高分子を溶解させて上記基材の表面から除去する工程を備える、上記細胞培養基材の製造方法に関する。
（【００１１】以降は省略されています）

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