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公開番号2025083327
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-30
出願番号2024201919
出願日2024-11-19
発明の名称平衡移動アルキル化試薬(ETAC)を用いる単一ドメイン抗体フラグメント(VHH)の部位特異的コンジュゲーション
出願人ミルテニーバイオテックベー.フェー. ウントコー. カー・ゲー,Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG
代理人アインゼル・フェリックス=ラインハルト,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C07K 1/13 20060101AFI20250523BHJP(有機化学)
要約【課題】部位特異的であり、生理学的条件下で安定であり、しかもジスルフィド結合で見られるようなタンパク質凝集を起こしにくいコンジュゲーション方法の提供。
【解決手段】検出可能なラベルを持つポリペプチドを提供するための方法であって、前記ポリペプチドは少なくとも5つのアミノ酸を含み、そのうち、第1のアミノ酸はシステインであり、かつ少なくとも1つの第2のアミノ酸はセリン、スレオニン、チロシン、リジン、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群より選択され、a)特定の試薬を与えることにより、第1のアミノ酸と第2のアミノ酸との間でマイケル付加を開始させる工程、b)2つの第2のアミノ酸間のマイケル付加生成物をレトロマイケル付加によって取り除くために、求核剤を加える工程を特徴とする方法である。
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【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
検出可能なラベルを持つポリペプチドを提供するための方法であって、前記ポリペプチドは少なくとも５つのアミノ酸を含み、そのうち、第１のアミノ酸はＣ（システイン）であり、かつ少なくとも１つの第２のアミノ酸はＳ（セリン）、Ｔ（スレオニン）、Ｙ（チロシン）、Ｋ（リジン）、Ｈ（ヒスチジン）およびＲ（アルギニン）からなる群より選択され、
ａ）式（Ｉ）
TIFF
2025083327000009.tif
41
170
（Ｉ）
［式中、
Ｒ
１
＝－ビオチン、チアミン、２～３０アミノ酸のペプチド、６～１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、－ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ、－Ｎ３，Ｎ３、－発蛍光団、－蛍光タンパク質
Ｒ
２
＝置換または無置換芳香族残基
Ｒ
３
＝Ｈ、Ｆ、ＮＯ
２
、炭素原子数１～５のアルキル
Ｒ
４
＝直接結合、炭素原子数１～２０の置換または無置換アルキル、アミンまたはアミド残基］
の試薬を与えることにより、第１のアミノ酸と第２のアミノ酸との間でマイケル付加を開始させる工程、
ｂ）２つの第２のアミノ酸間のマイケル付加生成物をレトロマイケル付加によって取り除くために、求核剤を加える工程
を特徴とする、方法。
続きを表示（約 1,700 文字）【請求項２】
少なくとも１つの第２のアミノ酸が前記ポリペプチドのＣ末端に設けられることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記求核剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ
３
）、ヒドラジン（Ｎ
２
Ｈ
４
）、テトラキス（ジメチルアミノ）エチレン（ＴＤＡＥ）、メルカプトエタノール、ギ酸、トリクロロシラン（ＨＳｉＣｌ
３
）、ホスフィン（ＰＨ
３
）、ジメチルスルフィドボラン（Ｍｅ
２
Ｓ・ＢＨ
３
）、チオ酢酸、トリス（トリメチルシリル）ホスフィン、トリ－ｎ－ヘキシルホスフィン、アンモニア（ＮＨ
３
）、システイン、セレノシステイン、チオフェノール、グルタチオン（ＧＳＨ）、ヨウ化物、メチルアミン、硫化水素からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試薬が、式（ＩＩ）
TIFF
2025083327000010.tif
45
170
（ＩＩ）
［式中、
Ｒ
１
＝－ビオチン、チアミン、２～３０アミノ酸のペプチド、６～１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、－ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ、－Ｎ３，Ｎ３、－発蛍光団
Ｒ
２
＝置換または無置換芳香族残基
Ｒ
３
＝Ｈ、Ｆ、ＮＯ
２
、炭素原子数１～５のアルキル
Ｒ
４
＝直接結合、炭素原子数１～２０の置換または無置換アルキル、アミンまたはアミド残基
Ｒ
５
＝直接結合、炭素原子数１～２０の置換または無置換アルキルまたはアミン残基
Ｒ
６
＝直接結合、炭素原子数１～２０の置換または無置換アルキルまたはアミン残基
Ｒ
７
＝炭素原子数１～２０の置換または無置換アルキル、カルボキシ、アミンまたはヒドロキシ残基］
を有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試薬が、式（ＩＩＩ）
TIFF
2025083327000011.tif
45
170
（ＩＩＩ）
［式中、
Ｒ
１
＝－ビオチン、チアミン、２～３０アミノ酸のペプチド、６～１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、－ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ、－Ｎ３，Ｎ３、－発蛍光団
Ｒ
２
＝置換または無置換芳香族残基
Ｒ
３
＝Ｈ、Ｆ、ＮＯ
２
、炭素原子数１～５のアルキル
Ｒ
４
＝直接結合、炭素原子数１～２０の置換または無置換アルキル、アミンまたはアミド残基
Ｒ
６
＝直接結合、炭素原子数１～２０の置換または無置換アルキルまたはアミン残基
Ｒ
７
＝炭素原子数１～２０の置換または無置換アルキル、カルボキシ、アミンまたはヒドロキシ残基］
を有することを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドのＣ末端に２～１０個のヒスチジン単位（Ｈ）が設けられることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）、抗体フラグメントまたはフルサイズの抗体であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＣＡＲ－アダプター分子において、細胞染色試薬において、細胞の分離／ラベル化／濃縮／枯渇プロセスにおいて、タンパク質精製において、および細胞活性化のために、ポリペプチドに検出可能なラベルを与えるための、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法の使用。

発明の詳細な説明【背景技術】
【０００１】
抗体およびその抗体フラグメント、例えばＶＨＨは、免疫治療用生体分子の重要な一クラスである。ＶＨＨは、そのユニークな分子特性、例えば小さなサイズ、単純な折り畳み、および改良された組織浸透性ゆえに、新しい治療アプローチに向けて、その重要性を増している。ＶＨＨの潜在的新規用途の１つは、ＡｄＣＡＲ（商標）Ｔ細胞と組み合わされるアダプター分子としてのそれらの使用である。
続きを表示（約 2,600 文字）【０００２】
したがってＶＨＨは、そのような目的のために修飾またはタグ付けされる必要がある。１つのアプローチは、腫瘍細胞とＣＡＲＴ細胞とを架橋して腫瘍細胞を死滅させるために、ＡｄＣＡＲ（商標）Ｔ細胞によって認識されるよう、化学タグに、例えばいくつか例を挙げると、ビオチン、チアミン、ペプチド、ＤＢＣＯ、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などに、化学的にコンジュゲートすることである。アダプター分子をＡｄＣＡＲ（商標）Ｔ細胞と一緒に使用すれば、投薬を制御することができ、その結果として安全性が確保される。というのも、これは、その必要が生じた場合には容易に取り除くことができ、患者へのリスクが最小限に抑えられるという特徴を持つからである。医薬品として適切であるために、アダプター分子の化学的コンジュゲーションは部位特異的であると共に、注射後の生理学的条件下で安定な、均一で明確に定義される生成物をもたらさなければならない。
【０００３】
部位特異的コンジュゲーションが可能になりうる状況の１つは、操作されたシステインの組み込みである。しかし遊離のシステインは、生産中または精製中にタンパク質の凝集につながるジスルフィド結合を形成しうる。現在使用されているもう１つの戦略は、マレイミドに基づく遊離システインのコンジュゲーションである。このアプローチの制約は、マレイミドチオール付加物が、生理学的還元条件下で不安定な化学的コンジュゲーションを生成しうることである。ここで起こるレトロマイケル付加がもたらすであろうアダプター分子は、非機能的であり、コンジュゲートされたアダプター分子のエピトープをブロックする可能性がある［１，２］。
【０００４】
単一ドメイン抗体フラグメントの部位特異的コンジュゲーションのための方法は、例えば操作されたシステインへのマレイミドの付加や、ソルターゼ反応など、数多く知られている［３］。
【０００５】
例えば米国特許第１１０２１５４４号明細書（Ｂ２）は、ＶＨＨを二量体化するためのＥＴＡＣ系（チオブリッジング（Ｔｈｉｏｂｒｉｄｇｉｎｇ））の使用を開示している。ここでは、システイン部分を含むＣ末端伸長部を特徴とするＶＨＨが、ＥＴＡＣ系（チオブリッジング）を介して連結されることで化学的に連結されたナノボディ二量体を生成し、診断薬、治療薬またはラベル化剤が導入される。
【０００６】
さらに刊行物［５］は、試薬を使ったビスアルキル化によるコンジュゲーションが、マイケル反応に依存する付加－脱離反応によって平衡制御されうることを開示している。共有結合によるコンジュゲーションは、空間的に近い２つのアミノ酸（例えばジスルフィドに由来する２つのシステインチオールまたはＣ末端もしくはＮ末端ｈｉｓタグ中の２つのヒスチジン）で起こる。
【０００７】
刊行物［６］では、ＥＴＡＣ試薬によるＨｉｓタグの修飾によって複数の試薬の付加が起こる可能性が記述されている。Ｈｉｓタグの修飾は、ＤＴＴのような強いマイケルドナーに対して安定ではない。コンジュゲートを安定化するために、導入されたＥＴＡＣリンカー中のケトンの還元が、トリアセトキシ水素化ホウ素を使って達成されるが、これはタンパク質の安定性とは両立しえないかもしれない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
米国特許第１１０２１５４４号明細書（Ｂ２）
【非特許文献】
【０００９】
Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａ．Ｄ．；Ｋｉｉｃｋ，Ｋ．Ｌ．「ＴｕｎａｂｌｅＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＭａｌｅｉｍｉｄｅ－ＴｈｉｏｌＡｄｄｕｃｔｓｉｎＲｅｄｕｃｉｎｇＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０１１，２２，１９４６－１９５３，ｄｏｉ：１０．１０２１／ＢＣ２００１４８Ｖ／ＳＵＰＰＬ＿ＦＩＬＥ／ＢＣ２００１４８Ｖ＿ＳＩ＿００１．ＰＤＦ
Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａ．Ｄ．；Ｋｉｉｃｋ，Ｋ．Ｌ．「ＲｅｖｅｒｓｉｂｌｅＭａｌｅｉｍｉｄｅ－ＴｈｉｏｌＡｄｄｕｃｔｓＹｉｅｌｄＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－ＳｅｎｓｉｔｉｖｅＰｏｌｙ（ＥｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌ）－ＨｅｐａｒｉｎＨｙｄｒｏｇｅｌｓ」Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２０１２，４，１３３－１４３，ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｃ２ＰＹ２０５７６Ａ
Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｄ．；Ｈｅｌｍａ，Ｊ．；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ａ．Ｆ．Ｌ．；Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ，Ｈ．；Ｈａｃｋｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．Ｐ．Ｒ．「Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ：ＣｈｅｍｉｃａｌＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎＳｔｒａｔｅｇｉｅｓａｎｄＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１８，５７，２３１４，ｄｏｉ：１０．１００２／ＡＮＩＥ．２０１７０８４５９
Ｐｅｃｉａｋ，Ｋ．；Ｌａｕｒｉｎｅ，Ｅ．；Ｔｏｍｍａｓｉ，Ｒ．；Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｗ．；Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉ，Ｓ．「Ｓｉｔｅ－ＳｅｌｅｃｔｉｖｅＰｒｏｔｅｉｎＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎａｔＨｉｓｔｉｄｉｎｅ」Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１９，１０，４２７－４３９，ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｃ８ＳＣ０３３５５Ｂ
Ｃｏｎｇ，Ｙ．；Ｐａｗｌｉｓｚ，Ｅ．；Ｂｒｙａｎｔ，Ｐ．；Ｂａｌａｎ，Ｓ．；Ｌａｕｒｉｎｅ，Ｅ．；Ｔｏｍｍａｓｉ，Ｒ．；Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．；Ｄｕｂｅｙ，Ｓ．；Ｐｅｃｉａｋ，Ｋ．；Ｂｉｒｄ，Ｍ．；ｅｔａｌ．「Ｓｉｔｅ－ＳｐｅｃｉｆｉｃＰＥＧｙｌａｔｉｏｎａｔＨｉｓｔｉｄｉｎｅＴａｇｓ」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２３，２４８－２６３，ｄｏｉ：１０．１０２１／ＢＣ２００５３０Ｘ／ＳＵＰＰＬ＿ＦＩＬＥ／ＢＣ２００５３０Ｘ＿ＳＩ＿００１．ＰＤＦ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、部位特異的であり、生理学的条件下で安定であり、しかもジスルフィド結合で見られるようなタンパク質凝集を起こしにくいコンジュゲーション方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

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