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公開番号2025072414
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-09
出願番号2025009893,2021575946
出願日2025-01-23,2020-06-23
発明の名称2成分系の分析物を測定するための方法およびキットならびにそれらの使用
出願人アクトーメゲーエムベーハー
代理人弁理士法人浅村特許事務所
主分類G01N 33/543 20060101AFI20250430BHJP(測定;試験)
要約【課題】2成分検出法を用いて分析物のパラメータを測定するための方法等の提供。
【解決手段】a.既知濃度で、非固定化の、分析物に特異的な2つの結合成分を提供し、分析物に特異的な2つの結合成分を分析物と接触させて、溶液中に形成される2成分/分析物複合体の濃度に依存するシグナルを生成することを含む、溶液中で2成分検出法を実施するステップと、
b.分析物に特異的な2つの結合成分と分析物との解離定数の関係についての数学関数である、2成分検出法のための解離定数関係を提供するステップと、
c.試料、分析物に特異的な結合成分の希釈物を調製するステップと、
d.2成分検出法を試料、希釈物に適用するステップと、
e.解離定数関係についての数学的適合のための制約入力として、試料および1つ以上の希釈物において検出されたシグナルを使用して、分析物に特異的な2つの結合成分の解離定数を決定するステップと、
を含む方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
２成分検出法を使用して、未知濃度の分析物を含む試料中の分析物の濃度を決定するための方法であって、
ａ．既知濃度で、非固定化の、分析物に特異的な２つの結合成分を提供し、前記分析物に特異的な２つの結合成分を前記分析物と接触させて、溶液中に形成された２成分／分析物複合体の濃度に依存するシグナルを生成することを含む、溶液中で２成分検出法を実施するステップと、
ｂ．前記分析物の濃度に対する前記シグナルの依存性を反映する数学関数である前記２成分検出法のための非全単射分析物濃度の基準曲線(a non-bijective analyte concentration reference curve)を提供するステップと、
ｃ．規定の希釈倍率を使用して前記試料の１つ以上の希釈物を調製するステップと、
ｄ．前記２成分検出法を前記試料および前記１つ以上の希釈物に適用するステップと、
ｅ．異なる分析物濃度での前記非全単射分析物濃度の基準曲線についての数学的適合のための制約入力（a constraining input）として、前記試料および前記１つ以上の希釈物において検出された前記シグナルを使用して前記分析物の濃度を決定するステップと、
を含む方法。
続きを表示（約 2,000 文字）【請求項２】
２成分検出法において既知濃度の試料中の分析物を用いて、分析物に特異的な結合成分の解離定数を決定するための方法であって、
ａ．既知濃度で、非固定化の、分析物に特異的な２つの結合成分を提供し、前記分析物に特異的な２つの結合成分を前記分析物と接触させて、溶液中に形成される２成分／分析物複合体の濃度に依存するシグナルを生成することを含む、溶液中で２成分検出法を実施するステップと、
ｂ．２成分／分析物複合体の濃度ならびに分析物および分析物に特異的な結合成分の濃度を反映する前記シグナルに依存して、分析物に特異的な２つの結合成分と分析物との解離定数（それぞれ、ｋｄ１およびｋｄ２）の関係についての数学関数である、前記２成分検出法のための解離定数関係を提供するステップと、
ｃ．前記試料および／または前記分析物に特異的な結合成分の１つ以上の希釈物を調製するステップと、
ｄ．前記２成分検出法を前記試料および前記１つ以上の希釈物に適用するステップと、
ｅ．異なる分析物濃度および／または分析物に特異的な結合成分濃度での前記解離定数関係についての数学的適合のための制約入力として、試料および１つ以上の希釈物において検出された前記シグナルを使用して、前記分析物に特異的な２つの結合成分の解離定数ｋｄ１およびｋｄ２を決定するステップと、
を含む方法。
【請求項３】
前記非全単射分析物濃度の基準曲線が、既知の分析物濃度の参照試料を提供し、前記参照試料の一連の既知希釈物を作製し、前記参照試料およびその各既知希釈物について前記２成分検出法を実行することによって実験的に得られ、および／または前記非全単射分析物濃度の基準曲線が、化学平衡および質量保存方程式を解くことによって解析的に算出されるか、または前記分析物に特異的な２つの各結合成分と前記分析物との解離定数の規定に基づいて数値解によって提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記解離定数の関係が、化学平衡および質量保存方程式を解くことによって解析的に算出される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記分析物が、タンパク質、ペプチド、核酸セグメント、炭水化物、脂質、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、抗原、オリゴヌクレオチド、特異的受容体タンパク質、リガンド、分子、細胞、微生物、ならびにそれらの断片産物または組み合わせからなる群から選択され、および／または前記試料が２つ以上の異なる種類の分析物を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記分析物に特異的な２つの結合成分が、核酸、好ましくはＲＮＡおよび／またはＤＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、ペプチド、タンパク質、アプタマー、分子インプリントポリマー、細胞またはそれらの組み合わせからなる群から選択され、および／または異なる種類の分析物に特異的な２対以上の結合成分が使用される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記２成分法が、前記２成分／分析物複合体の濃度依存性シグナルを生成するために近接度に基づいたアッセイを用いることを含み、前記近接度に基づいたアッセイが、それらの近接度に依存して検出可能なシグナルを生成する分析物に特異的な２つの結合成分を使用し、および／または前記２成分法が、共鳴エネルギー移動アッセイ、好ましくはフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイもしくは生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アッセイ、タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）、ＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎもしくはＤＮＡ標識近接アッセイ、好ましくは近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）もしくは近接伸長アッセイ（ＰＥＡ）を用いることを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記２成分検出法が、２成分／分析物複合体の濃度依存性シグナルを生成するために区画化アッセイを使用することを含み、前記シグナルが、単一の区画における前記分析物に特異的な２つの結合成分の存在を反映し、前記区画化アッセイが、好ましくは、エマルジョン滴法を使用し、前記エマルジョン中の各液滴が別個の区画を表し、より好ましくは、前記区画化アッセイがエマルジョンカップリングである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
複数の分析物が並列して決定される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記２成分検出法が、絶対分子数に基づく分析法を使用することを含み、および／または前記２成分検出法が、液滴デジタルＰＣＲアッセイを使用することを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、２成分検出法を使用して分析物のパラメータを測定する方法およびキットならびにそれらの使用に関する。特許請求される方法は、測定の測定可能な濃度範囲が拡張された分析物の希釈物の測定を含む。測定は、測定の所定の非全単射検量線に基づくものであり、それにより、測定ごとに２成分検出法の非全単射検量線を読み取る方法が提供される。これにより、分析物の濃度を算出するための数学的関係が、より広い測定範囲にわたって正確に決定される。別の態様では、本発明は、区画化２成分検出法における測定法の所定の非全単射検量線の適用に関する。さらに別の態様では、本発明は、区画化２成分検出法において同定された固有の分子成分を使用する測定法の所定の非全単射検量線の適用に関する。さらに別の態様では、本発明は、２成分法の分析物に特異的な結合成分の解離定数の決定に関する。特許請求される方法は、さらに並列様式での、測定の拡張された測定可能な濃度範囲、成分の解離定数の決定、および２成分検出法のよりすぐれた定量化に関する。
続きを表示（約 1,500 文字）【０００２】
本発明は、２成分検出法を使用して分析物のパラメータを測定する方法およびキットならびにそれらの使用に関する。本方法およびキットの適用も開示される。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の考察
具体的には、本方法およびキットは、２成分検出法を使用して分析物の濃度を決定するのに適しており、２成分検出法を使用したより大きい測定範囲およびその使用に関する。
【０００４】
飽和効果または「フック効果」は、一般に、特異的な結合相手または分析物を捕捉するために使用される試薬成分の飽和を伴う検出系に共通の現象である。しかしながら、数学的背景は、１成分または２成分の検出法の場合で異なる。
【０００５】
２成分検出系は、典型的には、２つの成分を適用して検出シグナルを生成する均一アッセイにおいて利用される。これらのアッセイの多くは、近接概念を適用し、分析物および成分を近接させてシグナルを生成する必要がある。ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）（Ｐｆｌｅｇｅｒ，Ｓｅｅｂｅｒ，＆Ｅｉｄｎｅ，２００６）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）－黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）対、ＰＣＡ（タンパク質相補性アッセイ）（Ｍｏｒｅｌｌ，Ｖｅｎｔｕｒａ，＆Ａｖｉｌｅｓ，２００９）、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（Ｔａｏｕｊｉ，Ｄａｈａｎ，Ｂｏｓｓｅ，＆Ｃｈｅｖｅｔ，２００９）、およびＤＮＡ標識近接法（ＰＬＡ－近接ライゲーションアッセイ、ＰＥＡ－近接伸長アッセイ）（Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇｅｔａｌ．，２００６）などの近接アッセイ技術、ならびにエマルジョンカップリングと呼ばれる近接度に基づかないアッセイは、２分子（２成分）検出系および検出法の代表例である。
【０００６】
１成分検出系では、シグナルを生成するために、トレーサと呼ばれる１つのアッセイ成分のみが必要とされる。放射性トレーサまたは蛍光トレーサを含む濾過結合アッセイは、１成分検出系の良好な例である。１成分検出系を使用して得られた検量線は、飽和トレーサ濃度で得られたプラトー（一般に「フック」とも呼ばれる）で終わる典型的なＳ字形を示す。これらの曲線は飽和曲線とも呼ばれる。
【０００７】
２分子検出系で作成された検量線は非定型である。これらの曲線は、非全単射であり、初濃度依存性シグナルの増加後に得られるプラトー後のシグナル減少（「フック効果」）を特徴とする。シグナルが低下し始める標的分子濃度の範囲は、フックポイントと呼ばれる。フックポイント未満では、アッセイ成分は標的分子によって徐々に飽和されていき、シグナル増加が測定される。フックポイントでは、両成分が標的分子で飽和し、最大シグナルが検出される。フックポイントを超えると、過剰な標的分子が成分を過飽和にし、それが会合を阻害し、漸進的なシグナル減少を引き起こす。
【０００８】
従来技術では、すべての測定が２セグメント非全単射検量線の漸進的に飽和したセグメントの範囲で行われることを確実にするために、分析物濃度の測定を実行する前に、２セグメント非全単射検量線のフックポイントを決定する必要がある。過飽和は、一般に測定の失敗とみなされる。
【０００９】
この要件の不履行は、決定値が非全単射検量線の分析物濃度に一意に対応しないため、誤った測定につながる可能性がある。
【００１０】
そのような誤差を回避するために、典型的には、測定のダイナミックレンジは、非全単射検量線の漸進的に飽和したセグメントのダイナミックレンジに制限される。
（【００１１】以降は省略されています）

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