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公開番号2025060869
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-10
出願番号2024229785,2020563892
出願日2024-12-26,2019-05-08
発明の名称パエニバシラスの突然変異体およびその使用方法
出願人バイエルクロップサイエンスエルピー,BAYER CROPSCIENCE LP
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 1/21 20060101AFI20250403BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】殺真菌活性および加工適正が増したパエニバシラス属菌(Paenibacillus sp.)の菌株を産生し、同定する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、機能的レシーバドメインまたは機能的DNA結合ドメインを欠く変異体DegUおよび/または機能的単一結合ドメインまたは機能的ATPアーゼドメインを欠く変異体DegSを含んだ液体培養において粘度が低下したパエニバシラス属菌の菌株の生物学的に純粋な培養物を含む組成物を提供する。また、パエニバシラス属菌の親株と比較して液体培養で粘度が低下したパエニバシラス属菌の変異誘導体株を、非ムコイド形態の変異株の視覚的スクリーニングによって同定する方法も提供する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
機能的レシーバドメインまたは機能的ＤＮＡ結合ドメインを欠く突然変異体ＤｅｇＵおよび／または機能的単一結合ドメインまたは機能的ＡＴＰアーゼドメインを欠く突然変異体ＤｅｇＳを含むパエニバシラス属菌の菌株の生物学的に純粋な培養物を含む組成物であって、突然変異体ＤｅｇＵおよび／または突然変異体ＤｅｇＳが、野生型ＤｅｇＵおよび野生型ＤｅｇＳを含むパエニバシラス属菌の菌株の液体培養物と比較して粘度が低下したパエニバシラス属菌の菌株の液体培養物をもたらす、前記組成物。
続きを表示（約 1,800 文字）【請求項２】
前記突然変異体ＤｅｇＵおよび／または突然変異体ＤｅｇＳが、ムコイド形態を有するパエニバシラス属菌の菌株のコロニーの形成を阻害する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記突然変異体ＤｅｇＵおよび／または突然変異体ＤｅｇＳがノックアウトであるか、または未成熟終止コドンの結果として切断されている、請求項１または請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記未成熟終止コドンが、配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１８位で切断された突然変異体ＤｅｇＵを生じる、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記突然変異体ＤｅｇＵが、配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた１０９位の小残基の酸性残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２２８位の小残基の極性残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた６３位の酸性残基の極性残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた１９５位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２０４位の疎水性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２０８位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１２位の塩基性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１７位の疎水性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２０７位の塩基性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１１位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１４位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換、を含む請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記突然変異体ＤｅｇＵが、Ｇ１０９Ｄおよび／またはＡ２２８Ｔおよび／またはＤ６３Ｎおよび／またはＮ１９５Ａおよび／またはＩ２０４Ａおよび／またはＴ２０８Ａおよび／またはＨ２１２Ａおよび／またはＬ２１７Ａおよび／またはＫ２０７Ａおよび／またはＮ２１１Ａおよび／またはＳ２１４Ａのアミノ酸置換を有する配列番号：２を含むか、或いはそれらの変異体であって保存アミノ酸置換を有する変異体を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記突然変異体ＤｅｇＳが、配列番号：４のアミノ酸配列との対応により番号付けされた９９位の疎水性残基の芳香族残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：４のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２９４位の酸性残基の塩基性残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：４のアミノ酸配列との対応により番号付けされた７３位の極性残基の小残基へのアミノ酸置換；および／または配列番号：４のアミノ酸配列との対応により番号付けされた１９０位の小残基の疎水性残基へのアミノ酸置換を含む、請求項１～６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
前記突然変異体ＤｅｇＳが、Ｌ９９Ｆおよび／またはＥ２９４Ｋおよび／またはＴ７３Ａおよび／またはＡ１９０Ｖのアミノ酸置換を有する配列番号：４を含むか、或いはそれらの変異体であって保存アミノ酸置換を有する変異体を含む、請求項１～７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
前記パエニバシラス属菌の菌株が突然変異誘発誘導株であり、非突然変異誘発親株と比較して増加したフサリシジン濃度を示す、請求項１～８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
前記パエニバシラス属菌の菌株が突然変異誘発誘導株であり、非突然変異誘発親株と比較して減少したアミラーゼの発現および／または酵素活性を示す、請求項１～９のいずれか一項記載の組成物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌株の分野、および植物病害を防除するそれらの能力に関する。特に、本発明は、比較的高いレベルの抗真菌活性を有し、かつ菌株の全培養液産物の下流処理および濃縮を促進する粘度が低下したパエニバシラス属菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）の菌株に向けられる。
続きを表示（約 1,800 文字）【０００２】
関連出願への相互参照：本出願は、２０１８年５月１４日付けで出願された米国仮特許出願第６２／６７１、０６７号に基づく優先権を主張しており、その内容の全体は参照することによってここに組み込まれている。
【０００３】
電子的に提出される配列表への参照：配列表の正式コピーは、ＡＳＣＩＩ形式の配列表として、２０１９年４月３０日に作成された「ＢＣＳ１６９００９＿ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の容量２９キロバイトのファイルにより、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で電子的に本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列リストは本明細書の一部であり、その全体が参照することによってここに組み込まれている。
【背景技術】
【０００４】
パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、低ＧＣ含量、内生胞子形成、グラム陽性菌（フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ））の属である。この属に属する細菌は、フサリシジンおよびポリミキシンのような非リボソームペプチドクラスを含む、工業的に関連する細胞外酵素および抗菌物質の多産生菌である。フサリシジン類は、種々の植物病原性真菌および細菌に対して抗微生物活性を有することが知られている。
【０００５】
多くのパエニバシラスの種は菌体外多糖類（ＥＰＳ）の多産生菌である。微生物ＥＰＳは水溶性生体高分子であり、細胞表面に付着し、細胞外培地に放出される。これらのポリマーは、その物理化学的およびレオロジー的特性により、食品、飼料、包装、化粧品および医薬品産業を含む広範囲の産業において、増粘剤として商業的に使用されている。ＥＰＳの産生は、特に高分子量種の結果として、全培養液試料の粘度増加をもたらす。培養液粘度の増加は、バイオリアクター増殖および生細菌全培養液製品を意図した培養液材料の下流処理の問題をもたらす。さらに処理する前に大規模発酵液体培養物からＥＰＳを除去するために、費用と作業集約的な手順が必要となる可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
低下した粘度と、より高レベルのフサリシジンおよびフサリシジン様化合物を示すことにより、殺真菌活性および加工適正（ｐｒｏｃｅｓｓａｂｉｌｉｔｙ）が増したパエニバシラス属菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）の菌株を産生し、同定する方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、パエニバシラス属菌の菌株およびその突然変異誘導体の殺真菌活性および加工適正を増強する戦略に向けられる。化学的処理と高スループットスクリーニングの連続ラウンドによりフサリシジンの生産を増強するための菌株改良戦略を考案した。さらに、パエニバシラス属菌株の殺真菌性突然変異誘導体の大規模増殖と下流処理を改善するために、発酵ブロス培養の粘度を低下させるための視覚スクリーニングを開発した。殺真菌性および加工特性を改良したパエニバシラス属菌株を数種作成し、特性化した。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、機能的レシーバドメインまたは機能的ＤＮＡ結合ドメインを欠く突然変異体ＤｅｇＵをおよび／または機能的単一結合ドメインまたは機能的ＡＴＰアーゼドメインを欠く突然変異体ＤｅｇＳを含むパエニバシラス属菌の菌株の生物学的に純粋な培養を含む組成物に関するものであり、ここで、突然変異体ＤｅｇＵおよび／または突然変異体ＤｅｇＳは、野生型ＤｅｇＵおよび野生型ＤｅｇＳを含むパエニバシラス属菌の菌株の液体培養と比較して粘度が低下したパエニバシラス属菌の菌株の液体培養物をもたらす。
【０００９】
特定の局面において、突然変異体ＤｅｇＵおよび／または突然変異体ＤｅｇＳは、ムコイド形態を有するパエニバシラス属菌の菌株のコロニーの形成を阻害する。
【００１０】
１つの実施形態において、突然変異体ＤｅｇＵおよび／または突然変異体ＤｅｇＳはノックアウトであるか、または未成熟終止コドンの結果として切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）されている。ある局面において、未成熟終止コドンは、配列番号：２のアミノ酸配列との対応により番号付けされた２１８位で切断された突然変異体ＤｅｇＵを生じる。
（【００１１】以降は省略されています）

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