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公開番号2025018380
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-06
出願番号2023122027
出願日2023-07-26
発明の名称プローブ及びその利用方法
出願人日華化学株式会社,国立大学法人福井大学
代理人弁理士法人快友国際特許事務所
主分類C12Q 1/6888 20180101AFI20250130BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】標的核酸を検出するためのプローブ及びその利用方法を提供する。
【解決手段】標的RNAに特異的にハイブリダイズする捕捉配列を規定するオリゴヌクレオチド領域を備え、オリゴヌクレオチド領域は、以下の式(1)及び/又は別の特定の構造で表されるヌクレオシドに由来する第1の単位と、前記標的RNA中のピリミジン塩基を光架橋する光架橋反応性基を含む少なくとも一つの第2の単位と、を有するプローブ。
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【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
標的ＲＮＡに特異的にハイブリダイズする捕捉配列を規定するオリゴヌクレオチド領域を備え、
前記オリゴヌクレオチド領域は、以下の式（１）及び／又は（２）で表されるヌクレオシドに由来する第１の単位と、前記標的ＲＮＡ中のピリミジン塩基を光架橋する光架橋反応性基を含む少なくとも一つの第２の単位と、を有するプローブ。
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2025018380000015.tif
62
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（式（１）及び式（２）中、Ｂは、それぞれ独立して、プリン－９－イル基、２－オキソ－ピリミジン－１－イル基、置換プリン－９－イル基、又は置換２－オキソ－ピリミジン－１－イル基を表す。）
続きを表示（約 730 文字）【請求項２】
前記第２の単位は、以下の式（３）及び（４）で表される単位からなる群から選択される1種又は2種のヌクレオシドに由来する単位である、請求項１に記載のプローブ。
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2025018380000017.tif
78
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【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド領域は、前記第２の単位以外の残余の全ての単位として前記第１の単位、を有する、請求項１又は２に記載のプローブ。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチド領域の３’末端及び／又５’末端に、前記標的ＲＮＡを検出するための標識要素を備える、請求項１に記載のプローブ。
【請求項５】
標的ＲＮＡを検出する方法であって、
前記標的ＲＮＡと、本プローブとをハイブリダイズする工程（ａ）と、
前記標的ＲＮＡと前記標的ＲＮＡに特異的にハイブリダイズする捕捉配列を規定するオリゴヌクレオチド領域を備え、前記オリゴヌクレオチド領域は、以下の式（１）及び／又は（２）で表される第１の単位と、前記標的ＲＮＡ中のピリミジン塩基を光架橋する光架橋反応性基を含む少なくとも一つの第２の単位と、を有するプローブとをハイブリダイズさせる工程（ａ）と、
前記標的ＲＮＡと前記プローブとがハイブリダイズしたハイブリダイズ産物において、光照射による架橋構造を形成させる工程（ｂ）と、
前記工程（ｂ）後に、前記架橋構造を備えるハイブリダイズ産物以外の前記ハイブリダイズ産物を除去する工程（ｃ）と、
を、備える、方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本明細書は、標的核酸を検出するためのプローブ及びその利用方法等に関する。
続きを表示（約 1,200 文字）【背景技術】
【０００２】
医療分野において、感染症の病原体の存否やその種類を特定することや、遺伝子関連疾患における遺伝子産物の存否や局在を評価することが重要である。
【０００３】
例えば、感染症の検査は特異性及び検出感度の点からＰＣＲでの実施が推奨されている。ＰＣＲでは原理的には１個のウイルス検出が可能であり、高い感度で病原体を特定することが期待される。
【０００４】
また、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、細胞、組織切片、さらには組織全体で、標的核酸の局在性をプローブを用いて可視化して検出する技術である。例えば、病理検体におけるＩＳＨは、標的遺伝子に由来する標的核酸の検出によって診断が可能となる感染症や腫瘍等の診断において有用である。ＩＳＨは、遺伝子の変異や増幅が観察される疾患における有用な診断ツールとなってきている。
【０００５】
これらの技術で標的核酸を検出するためのプローブとしては、ＤＮＡなどの天然型ヌクレオチドを用いた天然型プローブのほか、非天然型の骨格を用いた人工核酸プローブ、光架橋型人工核酸を用いた光架橋型人工核酸プローブ等が知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
特開２０２２－３９５２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ＰＣＲの場合には、生体試料からの抽出工程での低収率及び夾雑物による逆転写反応阻害やＰＣＲ反応阻害により感度が低下し偽陰性が発生する場合があった。
【０００８】
また、ＩＳＨの場合には、検出感度の向上のためには、標的核酸に対するハイブリダイゼーションの特異性を確保することが重要であるが、プローブのＴｍとストリンジェンシーの調整によるのでは、検出感度及び検出精度の向上には限界があった。
【０００９】
さらに、各種プローブには個別の問題が内在していた。天然型プローブは、容易に合成できるが、ヌクレアーゼ耐性が低いことと、標的核酸とのハイブリダイゼーションが水素結合にのみ依存するためハイブリダイズ産物の洗浄耐久性が低いことと、によって、検出感度及び検出精度を向上させることが困難であった。人工核酸プローブは、ヌクレアーゼ耐性に優れるものの、ハイブリダイゼーションが水素結合にのみ依存するため洗浄耐久性が低く、依然として検出感度の向上に限界があった。光架橋型人工核酸プローブでは、光架橋により標的核酸と共有結合するため特異性及び洗浄耐久性に優れているものの、ヌクレアーゼ耐性が低いために、検出感度が低下しやすいという問題があることがわかった。
【００１０】
このため、現時点において、標的ＲＮＡをハイブリダイゼーションによって検出するプローブとして、依然として検出感度及び検出精度に対する要請が存在していた。
（【００１１】以降は省略されています）

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