発明の詳細な説明【技術分野】 【０００１】 関連出願の相互参照 本出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる２０１８年５月１０日提出の米国仮出願番号第６２／６６９，４４２号の優先権を請求する。 続きを表示（約 3,900 文字）【０００２】 本発明の技術分野 本発明は、血液溶解物中の共有結合した化合物によるリアルタイムインビボ受容体占有率を直接測定するための方法に関する。より具体的には、本発明は、臨床薬の開発のための薬力学的バイオマーカーとしてのリアルタイムインビボＢＴＫ受容体占有率の測定に関する。 【背景技術】 【０００３】 本発明の背景技術 創薬と開発は、長期かつ高リスクのプロセスである。成功した新しい薬を開発するための平均コストは、早期の発見と開発プロセス間の数えきれない薬物候補の失敗について２６０億ドルとも推定され、臨床試験に入る薬物候補の全生存率は、１２％未満と推定されている（PhRMA Report, "Biopharmaceutical Research & Development: The Process Behind New Medicines", 2015）。これらの薬物候補の失敗を生じる主な問題は、後期開発段階、特に、概念実証（第ＩＩ期）臨床試験間における臨床的有効性が不十分であるか、または欠如することに関するものであった（Kola, I., et. al., J. Nature Reviews. Drug Discovery 2004, 3, 711-715; Arrowsmith, J., Nature Reviews. Drug Discovery 2011, 10, 87; Morgan, P., et. al., Drug Discovery Today 2012, 17, 419-424）。 【０００４】 開発中の多くの小分子薬物と生物製剤は、免疫系を調節するように設計されている。そのため、これらの薬物候補は、その所望される応答を得るために非常に低い用量レベルが必要とされることが多い。それゆえ、これらの薬物候補の薬物動態（ＰＫ）および薬物力学（ＰＤ）的特性の早期理解は、臨床試験のための適切な用量範囲を決定するために不可欠である（Topalian, S. L., et. al., The New England Journal of Medicine 2012, 366, 2443-2454; Brahmer, J. R., et. al., The New England Journal of Medicine 2012, 366, 2455-2465; Tolcher, A. W., et. al., Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology 2009, 27, 5800-5807; Hua, F., et. al., Journal of Clinical Pharmacology 2014, 54, 14-22; Rutgeerts, P. J., et. al., Gut 2013, 62, 1122-1130）。薬物開発段階中に臨床的有効性を向上させ、コストを減少させるために、ＰＤプロファイルの定量的測定は、臨床試験の合理的な設計のためのＰＫプロファイルと同様に重要である。これは、特にＰＤプロファイルが複数の用量で変化する場合に重要である。 【０００５】 受容体占有（ＲＯ）アッセイは、分子のその受容体タンパク質（または標的）への結合を測定し、ＰＤプロファイルを作成するために使用できる定量的データを供する（Liang, M., et. al., Cytometry B Clin Cytom 2016, 90, 117-127）。ＲＯの測定は、前臨床動物モデルおよび臨床試験においてメカニズムに関連する有効性に不可欠な測定である。実際に、ＲＯは、ファースト・イン・ヒューマン（ＦＩＨ）試験において用量漸増を決定するために特に有用である。 【０００６】 ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）は、Ｂ細胞受容体、Ｆｃ受容体－およびＲＡＮＫＬ経路を介したシグナル伝達および活性化において重要な役割を果たす（Seiler, T., et. al., Expert Opin Investig Drugs 2017, 26, 909-915; Whang, J. A., et. al., Drug Discovery Today 2014, 19, 1200-1204）。抗体に基づく薬物において、前記ＲＯは、通常、遊離受容体の測定のための標的分子と競合する抗体およびその合計受容体の測定のための非競合抗体を用いてフローサイトメトリーによってモニターされる（Liang, M, et. al., Cytometry B Clin Cytom 2016, 90, 117-127; Woska, J. R., Jr., et. al., Journal of immunological methods 2003, 277, 101-115）。しかしながら、小分子アンタゴニストにおいて、フローサイトメトリーによる占有された受容体を直接検出するための抗体試薬は存在していない。これまで、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるイブルチニブのＢＴＫ ＲＯは、遊離（占有されていない）ＢＴＫの活性な占有部位に結合する蛍光結合プローブを用い、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび蛍光ゲルスキャンニングを用いて検出することによって調べられた（Honigberg, L. A.; J. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2010, 107, 13075-13080）。蛍光結合プローブに基づくアッセイは、遊離ＢＴＫの量を測定することのみができ、ウェスタンブロットを用いるさらなるアッセイが合計ＢＴＫを測定するために必要とされている。臨床試験で生じる試料は大量であるため、２つのアッセイ基盤の使用は実用的ではない。さらに、前記方法は、結合していない測定と合計測定との間の直接的な比較可能性を欠き、高いアッセイバリエーションを生じる。 【０００７】 最近、ビオチン化共有結合プローブを用いたＥＬＩＳＡに基づくＢＴＫ ＲＯアッセイが、アカラブルチニブおよびＣＣ－２９２の臨床試験で報告され、利用されている（Barf, T., et.al., The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 2017; Evans, E. K., et. al., The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 2013, 346, 219-22）。この方法では、遊離ＢＴＫのみが検出され、薬物が結合したＢＴＫ（ＤＢ－ＢＴＫ）が洗い流される。合計ＢＴＫ濃度は、合計ＢＴＫレベルが試料中に一定のままであるものと推定し、投薬前の試料を用いて決定される。 【０００８】 あるいは、遊離および合計ＢＴＫのための別の時間分解蛍光エネルギー移動（ＴＲ－ＦＲＥＴ）に基づくアッセイは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＢＴＫ占有率を推定するために用いることができる（２０１６年１０月２３～２６日開催の第７回Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｍｅｔｒｉｃｓ（ＡＣｏＰ７）（ワシントン州、ベルビュー）におけるＬｕｔｚ，Ｊ．Ｄ．Ｎらのポスター発表）。しかしながら、前記遊離および合計ＢＴＫは、同一試料において同時ではなく別々に測定され、合計ＢＴＫレベルは、試料間で顕著に変動することが見出された（上記のHonigberg, L. A.）。それゆえ、前記ＥＬＩＳＡまたはＴＲ－ＦＲＥＴに基づく方法は、方法の選択から生じる固有の変動によって制限される。 【０００９】 液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）アッセイは、その優れたアッセイ選択性および多重化能力のため、タンパク質の定量における可能性を示している（Neubert, H., et. al., Bioanalysis 2014, 6, 1731-1733）。特に、免疫捕捉エンリッチメント（immunocapture enrichment）、続いてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ検出を組み合わせた「ハイブリッド」ＬＢＡ－ＬＣ－ＭＳアッセイは、優れた検出選択性でタンパク質バイオマーカーまたは治療薬を測定するための強力な技術基盤となっている（Stevenson, L., et. al., Bioanalysis 2013, 5, 2903-2918）。前記ＬＣ－ＭＳアッセイの主な利点は、同一試料においてＤＢ－ＢＴＫおよび遊離ＢＴＫの両方を同時に定量化するためのその能力である。それゆえ、前記ＲＯ測定は、試料またはランの変動性によって非常に影響を受けにくい。 【００１０】 しかしながら、ＬＣ－ＭＳアッセイの開発は、多くの難題を有する。第一に、薬物を投与した動物またはヒトに由来する血液試料は、過剰量の薬物を含みうるものであり、生体外で遊離受容体と反応して薬物結合受容体を形成し、その結果、ＲＯの過大評価となる。第二に、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、通常、ＥＬＩＳＡアッセイより感度が低い。 【発明の概要】 （【００１１】以降は省略されています） この特許をJ-PlatPatで参照する
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