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公開番号2025004975
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-16
出願番号2023104916
出願日2023-06-27
発明の名称細胞試料測定方法及び細胞試料測定装置
出願人浜松ホトニクス株式会社
代理人個人,個人,個人,個人
主分類G01N 21/64 20060101AFI20250108BHJP(測定;試験)
要約【課題】複数の細胞を含む細胞試料の培養状態についての測定を好適に行うことが可能な細胞試料測定方法及び細胞試料測定装置を提供する。
【解決手段】細胞試料測定装置1Aは、培養ディッシュ13上で培養された複数の細胞を含む対象細胞試料Sを載置する試料ステージ18と、対象細胞試料Sにおいて培養領域内を区分して設定されたN個の照射領域に対し、照射光源21から供給される中赤外域の波長を有する評価光をそれぞれ異なる照射量で照射する評価光照射部20と、対象細胞試料SのN個の照射領域のそれぞれについて、評価光の照射量に応じて発生した死細胞数を計測する死細胞数計測部30と、対象細胞試料Sについて、対象細胞試料Sの培養状態の評価の指標となる、N個の照射領域についての評価光の照射量と死細胞数との対象相関関係を求める培養状態解析部50とを備える。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
培養ディッシュ上で培養された複数の細胞を含む測定対象の対象細胞試料を試料ステージ上に載置する準備ステップと、
前記対象細胞試料において前記複数の細胞の培養領域内を区分して設定されたＮ個の照射領域（Ｎは２以上の整数）に対し、照射光源から供給される中赤外域の波長を有する評価光をそれぞれ異なる照射量で照射する評価光照射ステップと、
前記対象細胞試料の前記Ｎ個の照射領域のそれぞれについて、前記評価光の前記照射量に応じて発生した死細胞数を計測する死細胞数計測ステップと、
前記対象細胞試料について、前記対象細胞試料の培養状態の評価の指標となる、前記Ｎ個の照射領域についての前記評価光の前記照射量と前記死細胞数との対象相関関係を求める培養状態解析ステップと、
を備える、細胞試料測定方法。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
前記評価光照射ステップにおいて、前記Ｎ個の照射領域のそれぞれについて、前記評価光を照射するための複数の照射点を設定し、
前記死細胞数計測ステップにおいて、前記Ｎ個の照射領域のそれぞれについて、前記複数の照射点のそれぞれにおける前記死細胞数を計測する、請求項１に記載の細胞試料測定方法。
【請求項３】
前記評価光照射ステップにおいて、前記Ｎ個の照射領域に設定された全ての照射点を、前記培養領域内においてグリッド状に配置し、それらの照射点に対して順次に前記評価光を照射する、請求項２に記載の細胞試料測定方法。
【請求項４】
前記培養状態解析ステップにおいて、前記Ｎ個の照射領域について、各照射領域での前記評価光の前記照射量と、各照射領域の前記複数の照射点での前記死細胞数の平均値との前記対象相関関係を求める、請求項２または３に記載の細胞試料測定方法。
【請求項５】
前記死細胞数計測ステップにおいて、死細胞を選択的に染色する染色剤で染色した前記対象細胞試料の光像を撮像することで前記死細胞数を計測する、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞試料測定方法。
【請求項６】
前記染色剤は、蛍光色素であり、
前記死細胞数計測ステップにおいて、前記蛍光色素で染色した前記対象細胞試料に励起光を照射して生成された蛍光像を撮像することで前記死細胞数を計測する、請求項５に記載の細胞試料測定方法。
【請求項７】
前記評価光照射ステップにおいて、前記評価光の前記照射量は、前記評価光の前記照射領域への照射時間、照射パワー、及び集光条件のうち少なくとも１つを含む照射条件によって設定される、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞試料測定方法。
【請求項８】
前記評価光照射ステップにおいて、前記評価光の前記波長は、３μｍ以上２０μｍ以下の波長域で設定される、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞試料測定方法。
【請求項９】
前記評価光照射ステップにおいて、前記評価光を供給する前記照射光源は、量子カスケードレーザを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞試料測定方法。
【請求項１０】
前記評価光照射ステップにおいて、前記評価光の照射光軸に交差する面内で前記対象細胞試料を載置した前記試料ステージを駆動することで、前記培養領域内での前記評価光の照射位置を設定する、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞試料測定方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養ディッシュ上で培養された複数の細胞を含む細胞試料の培養状態について測定を行う細胞試料測定方法及び細胞試料測定装置に関するものである。
続きを表示（約 2,200 文字）【背景技術】
【０００２】
細胞を培養する技術は、細胞に関する基礎的な研究のみでなく、例えば再生医療などの実用分野においても重要である。細胞の培養においては、細胞系及び細胞株をさらに増殖させるため、細胞培養系から培地を除去し、培養していた細胞を新しい培地に移す、継代と呼ばれる操作が行われる。また、複数の細胞を培養した細胞試料において、継代操作を実施した回数を継代数という。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
特開２０１９－１５００１８号公報
特開２０１８－１３００９３号公報
【非特許文献】
【０００４】
P. Hughes et al., "Thecosts of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data dowe need?", Bio Techniques Vol.43 (2007), pp.575-586
E. Larson et al.,"Mid-infrared absorption by soft tissue sarcoma and cell ablationutilizing a mid-infrared interband cascade laser", J. Biomed. Opt. Vol.26(2021), pp.043012-1-043012-10
N. Malpica et al.,"Applying Watershed Algorithms to the Segmentation of ClusteredNuclei", Cytometry Vol.28 (1997), pp.289-297
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように複数の細胞を培養した細胞試料において、継代数や個々の継代操作の条件等は、細胞試料中で増殖した細胞の品質、培養状態等に影響を与える（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。すなわち、細胞試料の継代操作では、多くの場合、培養されている細胞は、新しい環境に移されることでダメージ、ストレス等を受けることによって、細胞の品質、状態が劣化する。
【０００６】
一般に、継代数が多くなるほど、培養細胞は分化増殖能の変化、形態の変化、遺伝子の変化などによって品質が劣化することが知られている。したがって、細胞試料の継代数、継代条件等の培養状態は、細胞試料を用いて実験、測定等を行う上で非常に重要な情報である。しかしながら、そのような細胞試料における細胞の培養状態を測定、評価する手法は、これまでに確立されていない。
【０００７】
本発明は、複数の細胞を含む細胞試料の培養状態についての測定を好適に行うことが可能な細胞試料測定方法及び細胞試料測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者は、複数の細胞が培養された細胞試料について、量子カスケードレーザ（ＱＣＬ：Quantum Cascade Laser）から供給されるレーザ光等を用いた光照射による細胞の活性化などの影響の研究を行っている。そのような細胞試料への光照射の影響の研究において、ある程度以上の照射量で光照射を行うと、死細胞が発生するとの知見を得た。さらに、そのような光照射による細胞死について詳細に調べたところ、死細胞の発生が、細胞試料の継代数などの培養状態に依存することを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明による第１態様の細胞試料測定方法は、（１）培養ディッシュ上で培養された複数の細胞を含む測定対象の対象細胞試料を試料ステージ上に載置する準備ステップと、（２）対象細胞試料において複数の細胞の培養領域内を区分して設定されたＮ個の照射領域（Ｎは２以上の整数）に対し、照射光源から供給される中赤外域の波長を有する評価光をそれぞれ異なる照射量で照射する評価光照射ステップと、（３）対象細胞試料のＮ個の照射領域のそれぞれについて、評価光の照射量に応じて発生した死細胞数を計測する死細胞数計測ステップと、（４）対象細胞試料について、対象細胞試料の培養状態の評価の指標となる、Ｎ個の照射領域についての評価光の照射量と死細胞数との対象相関関係を求める培養状態解析ステップと、を備える。
【００１０】
本発明による第１態様の細胞試料測定装置は、（１）培養ディッシュ上で培養された複数の細胞を含む測定対象の対象細胞試料を載置する試料ステージと、（２）対象細胞試料において複数の細胞の培養領域内を区分して設定されたＮ個の照射領域（Ｎは２以上の整数）に対し、照射光源から供給される中赤外域の波長を有する評価光をそれぞれ異なる照射量で照射する評価光照射部と、（３）対象細胞試料のＮ個の照射領域のそれぞれについて、評価光の照射量に応じて発生した死細胞数を計測する死細胞数計測部と、（４）対象細胞試料について、対象細胞試料の培養状態の評価の指標となる、Ｎ個の照射領域についての評価光の照射量と死細胞数との対象相関関係を求める培養状態解析部と、を備える。
（【００１１】以降は省略されています）

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