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公開番号2024180700
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-12-26
出願番号2024186469,2020161110
出願日2024-10-23,2020-09-25
発明の名称II型細胞膨化致死毒素産生菌による汚染可能性を判定する方法
出願人公立大学法人大阪,株式会社さくらコーポレーション,島津ダイアグノスティクス株式会社
代理人個人
主分類C12Q 1/689 20180101AFI20241219BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】II型細胞膨化致死毒素産生菌を効率良く検出する。
【解決手段】
II型細胞膨化致死毒素産生菌であるエシェリキア・アルバーティによる汚染可能性を判定する方法であって、判定対象である試料又は当該試料から抽出したDNAと接触させて当該試料中の対象遺伝子断片を増幅させる工程を有し、当該対象遺伝子断片を増幅させる工程において、好ましくは、配列番号48～58で示される塩基配列を有するプライマーの何れかと、配列番号59～67で示される塩基配列を有するプライマーの何れかからなるプライマーセットを用いる。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
エシェリキア・アルバーティによる汚染可能性を判定する方法であって、
判定対象である試料又は当該試料から抽出したＤＮＡと接触させて、当該試料中の対象遺伝子断片を増幅させる工程を有し、
当該対象遺伝子断片を増幅させる工程において、次のプライマーセットを用いる方法。
配列番号４８で示される塩基配列からなるプライマーと、
配列番号５９で示される塩基配列からなるプライマーと、
からなるプライマーセット
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
エシェリキア・アルバーティによる汚染可能性を判定する方法であって、
判定対象である試料又は当該試料から抽出したＤＮＡと接触させて、当該試料中の対象遺伝子断片を増幅させる工程を有し、
当該対象遺伝子断片を増幅させる工程において、次のプライマーセットを用いる方法。
配列番号４８で示される塩基配列からなるプライマーと、
配列番号５９～６７で示される塩基配列からなるプライマー群から選ばれる１つのプライマーと、
からなるプライマーセット
【請求項３】
エシェリキア・アルバーティによる汚染可能性を判定する方法であって、
判定対象である試料又は当該試料から抽出したＤＮＡと接触させて、当該試料中の対象遺伝子断片を増幅させる工程を有し、
当該対象遺伝子断片を増幅させる工程において、次のプライマーセットを用いる方法。
配列番号４８～５８で示される塩基配列からなるプライマー群から選ばれる１つのプライマーと、
配列番号５９で示される塩基配列からなるプライマーと、
からなるプライマーセット
【請求項４】
エシェリキア・アルバーティが有するII型細胞膨化致死毒素遺伝子の一部領域を増幅するためのプライマーセットであって、
配列番号４８で示される塩基配列からなるプライマーと、
配列番号５９で示される塩基配列からなるプライマーと、
からなるプライマーセット。
【請求項５】
エシェリキア・アルバーティが有するII型細胞膨化致死毒素遺伝子の一部領域を増幅するためのプライマーセットであって、
配列番号４８で示される塩基配列からなるプライマーと、
配列番号５９～６７で示される塩基配列からなるプライマー群から選ばれる１つのプライマーと、
からなるプライマーセット。
【請求項６】
エシェリキア・アルバーティが有するII型細胞膨化致死毒素遺伝子の一部領域を増幅するためのプライマーセットであって、
配列番号４８～５８で示される塩基配列からなるプライマー群から選ばれる１つのプライマーと、
配列番号５９で示される塩基配列からなるプライマーと、
からなるプライマーセット。
【請求項７】
エシェリキア・アルバーティ
による汚染可能性を判定するための測定キットであって、
請求項
４～６
の何れか１項に記載のプライマーセットを含む測定キット。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明はII型細胞膨化致死毒素産生菌による汚染可能性を判定する方法に関する。
続きを表示（約 2,000 文字）【背景技術】
【０００２】
近年、食中毒の原因菌の一つとしてエシェリキア・アルバーティ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａａｌｂｅｒｔｉｉ）が注視されている。この細菌（以下「アルバーティ菌」と言う場合がある。）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｏ１５７などと同様に腸管性出血を引き起こす可能性が高く、大腸菌と生化学的性状が酷似しているだけでなく、共通の病原因子として腸粘膜への接着に関するインチミンをコードしたｅａｅ遺伝子や、細胞膨化致死毒素（ＣｙｔｏｌｅｔｈａｌＤｉｓｔｅｎｄｉｎｇＴｏｘｉｎ：ＣＤＴ）関わる遺伝子（ｃｄｔ遺伝子）も保有することからも、両者を厳密に区別することが必要とされる。
【０００３】
両者を区別する方法として、特許文献１にはアルバーティ菌が分解しない糖とｐＨ指示薬を含む培地が開示されている。この培地を用いて培養することで、エシェリキア属の細菌群からエシェリキア・アルバーティを検出することができる。ところが、この培地においては、赤痢菌やプロビデンシア菌も同じようなコロニーを形成するために、エシェリキア・アルバーティであることを特異的に検出する必要が求められる。
【０００４】
ＣＤＴを産生する細菌は大腸菌やアルバーティ菌の他にも多数存在することが知られているが、大腸菌が産生するとされる５つのタイプのｃｄｔ（ｃｄｔＩ～Ｖ）遺伝子のうち、ｃｄｔ－Ｉ遺伝子、ｃｄｔ－III遺伝子、ｃｄｔ－IV遺伝子、ｃｄｔ－Ｖ遺伝子は、アルバーティ菌が保有するｃｄｔ遺伝子と相同性が低く、大腸菌の特定の株が保有するｃｄｔ－II遺伝子と相同性が高いことが明らかにされている（非特許文献１）。非特許文献１には、この知見を元にｃｄｔ－III遺伝子、ｃｄｔ－Ｖ遺伝子に加え、プロビデンシア・アルカリファシエンス（P.alcalifaciens）のｃｄｔ遺伝子を対象にして、アルバーティ菌が保有するｃｄｔ－II遺伝子を検出できるＰＣＲ法（ＥａｃｄｔＰＣＲ法）並びにネスティッドＰＣＲ法（ＮｅｓｔｅｄＥａｃｄｔＰＣＲ法）が開発されたことが明らかにされている。また、非特許文献２には当該ＥａｃｄｔＰＣＲ法に用いられた配列番号６９に示された塩基配列からなるプライマーと配列番号７０に示された塩基配列からなるプライマーが開示されている。
【０００５】
しかしながら、前者のＥａｃｄｔＰＣＲ法では検出下限が十分ではないだけでなく、後者のネスティッドＰＣＲ法では２段階の増幅が必要であるために、１段階の増幅でｃｄｔ－II遺伝子を他の４つのタイプのｃｄｔ遺伝子と区別して検出できる新たなプライマーが求められる。さらにｃｄｔ－II遺伝子にも一塩基多型などの変異があることが想定されるため、できる限り多くのｃｄｔ－II遺伝子を検出できる方法が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
特開２０１９－０２４４１８
【非特許文献】
【０００７】
安田憲朋、II型細胞膨化致死毒素遺伝子保有大腸菌の菌種再同定から見出したEscherichia albertiiの検出法の開発と応用、インターネット、＜URL：https://www.osakafu-u.ac.jp/osakafu-content/uploads/sites/428/k1798.pdf＞
Atsushi Hinenoya et al.、 Diagnostic Microbiology and Infection Disease 95(2019) 119-124
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願発明は、上記の背景技術に鑑みてなされたものであって、ネスティッドＰＣＲではなく１段階の増幅で検出が可能なＰＣＲでII型細胞膨化致死毒素産生菌を特異的に検出できるＰＣＲ用のプライマーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明は、II型細胞膨化致死毒素産生菌による汚染可能性を判定する方法であって、判定対象である試料又は当該試料から抽出したＤＮＡと接触させて、当該試料中の対象遺伝子断片を増幅させる工程を有し、当該対象遺伝子断片を増幅させる工程において、特定のプライマーセットを用いる方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本願発明によると、種々のＣＤＴ産生菌からII型細胞膨化致死毒素（II型ＣＤＴ）遺伝子（ｃｄｔ－II遺伝子）を特異的に検出し、当該ＣＤＴ産生菌による汚染可能性を迅速に判定できる。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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