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公開番号2024153690
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-29
出願番号2024113274,2021512433
出願日2024-07-16,2019-09-06
発明の名称ヒト多能性幹細胞からの造血前駆細胞の生成
出願人ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/0789 20100101AFI20241022BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】造血前駆細胞の生成方法を提供する。
【解決手段】造血前駆細胞を得るための方法であって、線維芽細胞増殖因子(FGF)及び血管内皮増殖因子(VEGF)を含む第1の化学的に定義された培養培地に低密度で播種された中胚葉細胞を培養し、それによって血管芽細胞を含む細胞集団を得る工程;及び(a)インスリン、FGF、VEGF、及びNotchアゴニスト、又は(b)幹細胞因子(SCF)、IL-3、及びトロンボポエチン(TPO)のどちらかを含む第2の化学的に定義された培養培地中で前記血管芽細胞を培養し、それによって造血前駆細胞を含む細胞集団を得る工程を含む、前記方法である。
【選択図】図1A-1F
特許請求の範囲【請求項1】
造血前駆細胞を得るための方法であって、
線維芽細胞増殖因子(FGF)及び血管内皮増殖因子(VEGF)を含む第1の化学的に定義された培養培地に低密度で播種された中胚葉細胞を培養し、それによって血管芽細胞を含む細胞集団を得る工程;及び
(a)インスリン、FGF、VEGF、及びNotchアゴニスト、又は(b)幹細胞因子(SCF)、IL-3、及びトロンボポエチン(TPO)のどちらかを含む第2の化学的に定義された培養培地中で前記血管芽細胞を培養し、それによって造血前駆細胞を含む細胞集団を得る工程
を含む、前記方法。
続きを表示(約 790 文字)【請求項2】
前記中胚葉細胞が、約6×10
3
細胞/cm
2
~約6×10
4
細胞/cm
2
の密度で播種される、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記造血前駆細胞が、CD34+CD45+造血前駆細胞である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項4】
前記中胚葉細胞が、ブラキュリ(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、及びMSX2からなる群より選択される1種以上の中胚葉マーカーを発現する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項5】
前記第2の化学的に定義された培養培地が、FGF、VEGF、及びNotchアゴニストを含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項6】
前記Notchアゴニストが、レスベラトロール(3,4',5-トリヒドロキシスチルベン)、バルプロ酸、及びスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
【請求項7】
前記第2の化学的に定義された培養培地が、SCF、IL-3、及びTPOを含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項8】
前記第1の化学的に定義された培養培地が、Notchアゴニスト、TGFβインヒビター、又はイノシトールモノホスファターゼのインヒビターをさらに含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項9】
前記TGFβインヒビターが、SB431542である、請求項8に記載の方法。
【請求項10】
前記イノシトールモノホスファターゼのインヒビターが、L-690,330である、請求項8又は9に記載の方法。
(【請求項11】以降は省略されています)

発明の詳細な説明【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体を参照することにより本明細書に援用する2019年9月7日に提出された米国仮特許出願第62/728,408号に対する優先権を主張する。
続きを表示(約 7,000 文字)【背景技術】
【0002】
背景
造血前駆細胞の生成は、血管障害の治療に有望なアプローチであるが、この目標は困難なままである。2つの最近の研究では、トランスジェニック法を利用して、免疫力が低下したマウスに生着することができる造血細胞を生成した(Lis et al., 2017; Sugimura et al., 2017)。しかしなら、トランスジェニック法は、臨床適用のためにスケールアップすることができない。当技術分野は、動物又はヒト対象に生着することができる造血前駆細胞を生成するための大規模な臨床適用可能な方法を必要としている。
【発明の概要】
【0003】
発明の概要
本明細書では、第1の態様において、造血前駆細胞を得るための方法であって、線維芽細胞増殖因子(FGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、並びにNotchアゴニスト、TGFβインヒビター、及びイノシトールモノホスファターゼのインヒビターの少なくとも1種を含む化学的に定義された培養培地(chemically-defined culture medium)に低密度で播種された中胚葉細胞を培養し、それによって血管芽細胞を含む細胞集団を得ること;及びインスリン、FGF、VEGF、及びNotchアゴニストを含む化学的に定義された培養培地内で血管芽細胞を培養し、それによってCD34+CD45+造血前駆細胞を得ること含む方法について記載する。いくつかの実施形態では、中胚葉細胞は、約6×10
3
細胞/cm
2
と約6×10
4
細胞/cm
2
の間の密度で播種される。いくつかの実施形態では、中胚葉細胞は、ブラキュリ(Brachyury)(T)、EMOS、FOXA2、MIXL1、MSX1、及びMSX2からなる群より選択される1種以上の中胚葉マーカーに発現する。いくつかの実施形態では、Notchアゴニストは、レスベラトロール(3,4',5-トリヒドロキシスチルベン)、バルプロ酸、及びスベロイルビスヒドロキサム酸からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、TGFβインヒビターはSB431542である。いくつかの実施形態では、イノシトールモノホスファターゼのインヒビターはL-690,330である。
【0004】
いくつかの実施形態では、中胚葉細胞は、骨形成タンパク質4(BMP4)、アクチビンA、及びWnt/βカテニンシグナル伝達のアクチベーターを含む無血清でアルブミン非含有の化学的に定義された培養培地中で約2日間にわたってヒト多能性幹細胞を培養して、中胚葉細胞を含む細胞集団を得ることによって得られる。いくつかの実施形態では、ヒト多能性幹細胞は、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、約6×10
3
細胞/cm
2
と約6×10
4
個に細胞/cm
2
の間の密度で播種される。いくつかの実施形態では、Wnt/βカテニンシグナル伝達のアクチベーターは、Gsk3インヒビターである。いくつかの実施形態では、Gsk3インヒビターは、CHIR99021、CHIR98014、BIO-アセトキシム、BIO,LiCl、SB216763、SB415286、AR A014418、1-アザケンパウロン、及びビス-7-インドリルマレイミドからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、中胚葉細胞が約4日間培養された後に血管芽細胞が約4日間培養されて、造血前駆細胞を含む細胞集団を生成する。
【0005】
本明細書では、第2の態様において、本明細書に記載の方法に従って得られたCD34+CD45+造血前駆細胞の実質的に純粋な単離された集団について述べる。いくつかの実施形態では、単離された集団は、少なくとも90%の造血前駆細胞を含む。いくつかの実施形態では、単離された集団は、少なくとも99%の造血前駆細胞を含む。
本明細書では、第3の態様において、本明細書に記載の方法に従って得られる多能性幹細胞由来CD34+CD45+造血前駆細胞の実質的に純粋な単離された集団について述べる。
本明細書では、第4の態様において、患者の血管疾患の治療方法であって、本明細書に記載の方法に従って得られたCD34+CD45+造血前駆細胞の治療量を患者に投与することを含む方法について述べる。いくつかの実施形態では、疾患は、貧血症、サラセミア、赤血球増加症、尿毒症、骨髄線維症、骨髄腫、脊髄形成異常症、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、異常ヘモグロビン症、好中球減少症、血小板減少症、フォン・ヴィルブランド病、血友病、原発性血小板血症、後天性血小板機能障害、形質細胞障害、及び固形腫瘍からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、造血前駆細胞は、製剤で投与され、この製剤は、静脈内デリバリーに適した形態である。
【0006】
本明細書では、第5の態様において、マクロファージを得る方法であって、(i)本明細書に記載の方法によって生成されたCD34+CD45+造血前駆細胞を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む培地中で約3日間培養すること;及び(ii)(i)の培養された細胞を、インターロイキン1β(IL-1B)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、血清又は血清代替物を含む培地中で培養し、それによってマクロファージを含む細胞集団を得ることを含む方法について述べる。いくつかの実施形態では、細胞集団は少なくとも80%のCD11b
+
CD14
+
マクロファージを含む。
本明細書では、第6の態様において、ナチュラルキラー(NK)細胞を得る方法であって、本明細書に記載の方法によって生成されたCD34+CD45+造血前駆細胞集団を、ウシ血清アルブミン、インスリン、及びトランスフェリンを含む培地中で約3日間培養して、接着細胞及び浮遊細胞を含む細胞集団を生成すること;及び浮遊細胞を、インターロイキン7(IL-7)、インターロイキン15(IL-15)、幹細胞因子(SCF)、及びFlt3リガンド(FLT3-L)を含む培地中で培養し、それによってNK細胞を含む細胞集団を生成すること含む方法について述べる。いくつかの実施形態では、NK細胞を含む細胞集団は、少なくとも60%のCD56
+
CD3
-
NK細胞を含む。いくつかの実施形態では、浮遊細胞は、さらに血清又は血清代替物を含む培地中で培養される。
【0007】
本明細書では、第7の態様において、T細胞を得る方法であって、本明細書に記載の方法で生成されたCD34+ CD45+造血前駆細胞を、インターロイキン7(IL-7)、Flt3リガンド(FLT3-L)、幹細胞因子(SCF)、及びRESVを含む培地中で培養して、T細胞を含む細胞集団を生成することを含む方法について述べる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、少なくとも約90%のCD3
+
CD4
+
CD8
+
T細胞を含む。いくつかの実施形態では、この培地は、さらに血清又は血清代替物を含む。
【図面の簡単な説明】
【0008】
図1Aは、本発明に従う造血細胞分化に関し、多能性細胞の動脈内皮細胞及び造血細胞へのin vitro分化の概略を示し、多能性細胞は高細胞密度又は低細胞密度で播かれる。この図に示す実験の高細胞密度法の細胞は1.1×10
5
細胞/cm
2
で播かれ、この図に示す実験の低細胞密度法の細胞は1.8×10
4
細胞/cm
2
で播かれた。図1Bは、10日目の各培養の細胞の細胞形態を示す写真である。低細胞密度培養法では円形浮遊細胞が観察された。図1Cは、低細胞密度培養の細胞における0日目及び10日目のCD34及びCD45発現のフローサイトメトリー分析を示す。図1Dは、低細胞密度(LD)及び高細胞密度(HD)培養のそれぞれの10日目におけるCD144発現のフローサイトメトリー分析を示す。図1Eは、12ウェルプレートの1ウェル内で10日目に3つの多能性細胞株、すなわち、H1(ES)、H9(ES)、又はPBMC-3-1(iPS)細胞から生成された総造血細胞数(浮遊細胞)を示す。図1Fは、NUNCのトリプルフラスコ(TripleFlask)1つから生成された総造血細胞数(浮遊細胞)を示す。造血細胞は、10日目に凍結保存することができ(90% FBS+10% DMSO)、血管芽細胞は、6日目に凍結保存することができる。
図2Aは、低密度及び高密度細胞培養におけるNotch及びYAPシグナル伝達を示し、YAPの免疫染色を示す。図2Bは、低密度及び高密度細胞培養におけるNotch及びYAPシグナル伝達を示し、NICD1(Notch細胞内ドメイン)の免疫染色を示す。図2Cは、高密度培養における10日目の細胞の形態を示す。高密度で培養された細胞は、10μMのDAPT(Notchインヒビター)の有り無しで2日目~10日目まで処理された。図2Dは、高密度条件下で10μMのDAPTの非存在下又は存在下で2日目~10日目に生成された総造血細胞数(浮遊細胞)の統計を示す。
図3Aは、低密度及び高密度細胞培養におけるBMP4シグナル伝達を示し、pSMAD1/5/8の免疫染色を示す。図3Bは、低密度(LD)又は高密度(HD)のどちらかで培養された細胞からのリン酸化SMAD1/5/8(pSMAD1/5/8)、SMAD1/5/8、及びGAPDHのウエスタンブロットを示す。図3Cは、50ng/mlのBMP4有り無しで高密度にて培養された細胞の10日目の細胞形態の写真を示す。図3Dは、LDN(BMPシグナル伝達インヒビター)の有り無しで低密度にて培養された細胞の10日目の細胞形態の写真を示す。図3Eは、総造血細胞数の統計を示す。
コロニー形成単位アッセイの結果を示し、10日目の造血細胞をMethoCult(商標)と混合し、2週間培養した。
図5Aは、造血前駆細胞のマクロファージへの分化を示し、マクロファージ/ミクログリア分化の概略を示す。図5Bは、ウシ胎仔血清(FBS)又はノックアウト血清代替物(KOSR)の存在下で図5Aに示すように培養された細胞の19日目におけるCD14及びCD11b発現のフローサイトメトリー分析を示す。図5Cは、13日目にFBS又はKOSRと共に培養し始めた細胞の19日目の細胞形態の写真を示す。図5Dは、ミクログリア/マクロファージによるファゴサイトーシスを示す。ザイモサンA(出芽酵母)BioParticles(登録商標)(Texas Red(登録商標)抱合体;Life Technologies)はPBS(10mg/ml=2×10
9
粒子/ml)中で調製した。4×10
5
個のマクロファージを含有する2mlのE6M培地に20μlの粒子を添加した。ファゴサイトーシスを経時的に画像化した。
図6Aは、造血前駆細胞のナチュラルキラー(NK)細胞への分化を示し、NK細胞分化の概略を示す。図6Bは、H1、H9、及びPBMC-3-1細胞株から産生された造血前駆細胞から分化した細胞の27日目におけるCD56及びCD3発現のフローサイトメトリー分析を示す。図6Cは、NK死滅アッセイの細胞死滅統計を示す。H1-NK細胞:U936/K572=1:1。生きているU936又はK572細胞を24時間後に分析した。
図7Aは、造血前駆細胞のT細胞への分化を示し、T細胞分化の概略を示す。図7Bは、34日目のCD3、CD4、及びCD8発現のフローサイトメトリー分析を示す。
図8Aは、造血前駆細胞のin vivo生着を示し、注射8週間後の末梢血液中のヒトCD45(hCD45)及びマウスCD45(mCD45)発現のフローサイトメトリー分析を示す。静脈内注射(後眼窩)はNBSGWマウスに3×10
5
細胞(100ulのHBSS中)/マウスで行なった。注射8週間後に末梢血液を採取した。図8Bは、マウス末梢血液中に存在するhCD45
+
細胞の統計を示す。図8Cは、4.5×10
5
細胞(30ulのHBSS中)/マウスの用量でNBSGWマウスの大腿内動脈(intra-femoral artery)に注射したH1(雄性ESC)及びH9(雌性ESC)由来造血前駆細胞の比較を示す。注射12週間後に末梢血液を採取した。「D10」は、10日目に凍結保存された細胞を示す。移植の1日前に、細胞を解凍し、SEFM+100ng/mlのSCF中で24時間培養した。24時間後、浮遊HPCだけを移植用に採取した。「D6」は、6日目に凍結保存された細胞を示す。移植の1日前に、細胞を解凍し、SEFM+100ng/mlのSCF中で24時間培養した。24時間後、浮遊HPCと接着血管芽細胞を両方とも移植用に採取した。hCD45
+
細胞の統計を示した。
造血前駆細胞を生成するための代替方法を示す。ES/iPS細胞をE8BAC培地中で2日間(44時間)培養した(1.1×10
5
細胞/cm
2
)。この長さに時間後に細胞を凍結保存することができた。さらなる分化のため、細胞をE6T培地(10μMのY-27632添加)で継代し(1:6比)、18時間培養した。次に培地を「5因子」培地に8日目まで変えた。8日目から12日目まで培養をFVR培地中で維持した。12日目に造血細胞を凍結保存することができた。
【発明を実施するための形態】
【0009】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも一部は、アルブミンを含まず、異種物質非含有(「ゼノフリー」)の化学的に定義された条件下でヒト多能性幹細胞を造血前駆細胞(HPC)に分化させるためのプロトコルの発明者らの開発に基づいている。多能性細胞は、ヒト胚性幹細胞(ヒトES細胞又はhES細胞)又はヒト人工多能性幹細胞(ヒトiPS細胞又はhiPS細胞)であり得る。特に、多能性細胞を該培地に低細胞密度で播種すると、CD34
+
/CD45
+
造血前駆細胞の集団を生成することができる。これらの発見に基づいて、本発明は、臨床細胞療法及び組織モデリング用途に使用するために臨床関連ヒト造血前駆細胞を生成して増やすための完全に定義されたゼノフリー方法を提供する。本明細書で使用する場合、用語「造血前駆細胞」は、in vivo及びin vitroで、骨髄又は生成されたリンパ球系細胞中に保持されるマーカーを与えることによって追跡し得る造血によって骨髄細胞及びリンパ球系血液細胞をもたらし、かつ本明細書で提供するin vitro方法に従って得られる細胞を指す。いくつかの天然に存在するHPCは分化系列決定され、1つの細胞型に分化できるだけであるが、本発明のHPCは多能性であり、骨髄とリンパ球系の両方の細胞に分化する能力があると特徴づけられる。本発明のHPCは、CD34及びCD45等の造血前駆細胞マーカーの高レベルの発現を特徴とする。HPCは、マーカーCD34、CD43、CD49f、及びCD90の発現をも特徴とする。HPCは、本明細書に記載のようにin vitro及びin vivoでの細胞の特徴的な発現プロファイル及び機能的属性に基づいて他の細胞型と識別できる。具体的には、本発明のHPCは、移植後に生着することができる。
本発明は、本明細書に記載の方法によって生成された造血前駆細胞からマクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞、及びT細胞を生成する方法をも提供する。
【0010】
方法
特定の好ましい実施形態では、HPCは、本明細書に記載どおりに多能性細胞から生成された中胚葉細胞から得られる。HPCは、他の方法を用いて作られた中胚葉細胞から得ることもできるが、該方法は、効率が低く、より少ないHPCが得られる。
本明細書では、第1の態様において、HPCを得る方法を提供する。例示実施形態では、方法は、中胚葉細胞の血管芽細胞への分化を誘導する第1のステップ及び血管芽細胞の造血前駆細胞への分化を誘導する第2のステップを含む。
(【0011】以降は省略されています)

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