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公開番号2024114756
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-08-23
出願番号2024099565,2021512530
出願日2024-06-20,2019-09-07
発明の名称ユニバーサルドナー細胞
出願人クリスパーセラピューティクスアクチェンゲゼルシャフト
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/10 20060101AFI20240816BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】複数の対象に適合する遺伝子改変細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞、及び前記遺伝子改変細胞を作製する方法が、本明細書で提供される。
ここから発明の課題を簡潔に記載して下さい。
【解決手段】ユニバーサルドナー細胞は、1つ以上のMHC-I若しくはMHC-IIヒト白血球抗原又はMHC-I若しくはMHC-II複合体の構成要素若しくは転写調節因子をコードする少なくとも1つの遺伝子内又は近傍での少なくとも1つの遺伝子改変、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドの発現を増加させる少なくとも1つの遺伝子改変、及び任意選択により、生存因子をコードする少なくとも1つの遺伝子の発現を増加させるか又は減少させる少なくとも1つの遺伝子改変を含む。
【選択図】図1A
特許請求の範囲【請求項１】
ユニバーサルドナー細胞を作製する方法であって、
（ｉ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子のうちの１つ以上をコードする少なくとも１つの遺伝子内又は近傍の部位で前記細胞のゲノム中の少なくとも１つの塩基対の欠失及び／又は挿入を導入すること；並びに
（ｉｉ）前記細胞のゲノムにおいて（ｉ）の前記部位に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位で免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの挿入を導入することによって、細胞を遺伝子改変し、それにより前記ユニバーサルドナー細胞を作製することを含む方法。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
ユニバーサルドナー細胞を作製する方法であって、
（ｉ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子のうちの１つ以上をコードする少なくとも１つの遺伝子内又は近傍の部位で前記細胞のゲノム中の少なくとも１つの塩基対の欠失及び／又は挿入を導入すること；並びに
（ｉｉ）前記細胞のゲノムにおいてセーフハーバー座位に免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの挿入を導入することによって、細胞を遺伝子改変し、それにより前記ユニバーサルドナー細胞を作製することを含む方法。
【請求項３】
前記ユニバーサルドナー細胞が、未改変細胞と比較して免疫回避及び／又は細胞生存の増加を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上のＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又は前記ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の前記構成要素若しくは前記転写調節因子をコードする前記少なくとも１つの遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、若しくはＨＬＡ－Ｃから選択されるＭＨＣ－Ｉ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、若しくはＨＬＡ－ＤＲから選択されるＭＨＣ－ＩＩ遺伝子、又はＢ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、若しくはＲＦＸＡＮＫから選択される遺伝子である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
免疫寛容原性因子をコードする前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４、又はＣＤ４７のうちの１つ以上をコードする１つ以上のポリヌクレオチドである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
免疫寛容原性因子をコードする前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、外来プロモーターに作動可能に連結される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記外来プロモーターが、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、又は細胞型特異的プロモーターであり、任意選択により、前記外来プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦｌａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、又はＵＢＣプロモーターである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）の前記欠失及び／又は挿入が、Ｂ２Ｍ内又は近傍にあり、且つ（ｉｉ）の前記挿入が、ＰＤ－Ｌ１又はＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法がさらに、未改変細胞に対して、少なくとも１つの生存因子の発現を増加させるか又は減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を導入することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの生存因子の発現を増加させるか又は減少させる前記少なくとも１つの遺伝子改変が、前記未改変細胞に対してＭＡＮＦの発現を増加させる、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドの挿入；又は前記未改変細胞に対してＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、若しくはＪＮＫの発現を減少させるか又は消失させる、ＺＮＦ１４３、ＴＸＮＩＰ、ＦＯＸＯ１、若しくはＪＮＫをコードする遺伝子内又は近傍での少なくとも１つの塩基対の欠失及び／若しくは挿入である、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年９月７日に出願された米国仮特許出願第６２／７２８，５２９号明細書の利益を主張するものであり、その開示は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 4,900 文字）【０００２】
本発明は、遺伝子編集の分野に関し、いくつかの実施形態では、複数の対象に適合する細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞を作製するための遺伝子改変に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＬＡ適合、抗体によりＴ細胞活性化を誘発する経路の遮断、免疫抑制剤のカクテルの使用、及び自己細胞療法を含む、移植された細胞又は生着された細胞の同種拒絶を克服するために、様々な手法が提案されてきた。移植片拒絶を弱める別の戦略は、移植された細胞又は生着された細胞とレシピエントの間の同種間相違の最小化を含む。６番染色体上のヒト主要組織適合抗原複合体に位置する遺伝子によってコードされる分子である細胞表面に発現されるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、免疫拒絶の主要なメディエーターである。ドナーと対象の間の単一のＨＬＡ遺伝子の不一致が、強い免疫応答を引き起こし得る（ＦｌｅｉｓｃｈｈａｕｅｒＫ．ｅｔａｌ．「Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ－ａｌｌｏｇｒａｆｔｒｅｊｅｃｔｉｏｎｂｙＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇａｓｉｎｇｌｅａｍｉｎｏａｃｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎＨＬＡ－Ｂ４４」，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．，１９９０，３２３：１８１８－１８２２）。ＨＬＡ遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）及びＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）に分類される。ＭＨＣ－Ｉ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ）は、ほとんど全ての組織型において発現され、「非自己」の抗原がプロセシングされたペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞に提示し、それにより細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞へのそれらの活性化を促進する。「非自己」ＭＨＣ－Ｉ分子を発現する移植された細胞又は生着された細胞は、これらの細胞に向けられる強い細胞性免疫応答を引き起こすことになり、最終的に、活性化された細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞によるそれらの消滅をもたらす。ＭＨＣ－Ｉタンパク質は、本質的に、小胞体中のベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と関連し、これは細胞表面上で機能的ＭＨＣ－Ｉ分子を形成するのに必須である。
【０００４】
ＭＨＣ－Ｉ遺伝子の広範な細胞での発現とは対照的に、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の発現は、樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞などの抗原提示細胞に制限される。ＨＬＡ抗原遺伝子は、ヒトゲノムにおいて観察される最も多型の遺伝子である（ＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎＰ．，「ＨＬＡｍａｔｃｈｉｎｇｆｏｒｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ－－ｈｏｗｍｕｃｈｉｓｅｎｏｕｇｈ？」ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．，２００１，３４５：１８４２－１８４４）。どのＨＬＡ遺伝子型とも適合する「ユニバーサルドナー」細胞の作製は、免疫拒絶及び免疫回避のための既存の方法論の関連する経済的コストを解決し得る代替の戦略を提供する。
【０００５】
そのようなユニバーサルドナー細胞の系列を作製するために、先行する１つの手法は、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩクラス遺伝子の発現を機能的に破壊した。これは、例えば、ＭＨＣ－Ｉ軽鎖、Ｂ２Ｍをコードする両方の遺伝子アレルの遺伝子破壊により活性化され得る。得られたＢ２ＭＫＯ細胞株及びその派生体は、表面ＭＨＣ－Ｉの著しい減少、それにより同種のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する免疫原性の低減を呈すると予想されるであろう。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）で標的化する手法を使用して、Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン２中の数ヌクレオチドの欠失によってＢ２Ｍ欠損ｈＥＳＣ株を作製してきた（Ｌｕ，Ｐ．ｅｔａｌ．，「Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｈｙｐｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｙｔｈｅｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｂｅｔａ２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ」，ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｖ．２０１３，９：８０６－８１３）。Ｂ２Ｍ標的化ｈＥＳＣ株は表面ＨＬＡ－Ｉ欠損であると思われたが、それらは、依然としてＢ２Ｍ及びＭＨＣ－Ｉに特異的なｍＲＮＡを含有することが見出された。Ｂ２Ｍ及びＭＨＣ－ＩｍＲＮＡは、非標的化ｈＥＳＣのものと同等のレベルで発現された（両方ともに構成的であり且つＩＦＮ－ｇ誘導性）。したがって、これらのＴＡＬＥＮＢ２Ｍ標的化ｈＥＳＣ株は、Ｂ２ＭｍＲＮＡも発現するＢ２Ｍ２／２マウス細胞で観察されたように、免疫拒絶を引き起こすのに十分であると考えられる残留の細胞表面ＭＨＣ－Ｉを発現する可能性があるという懸念がある（Ｇｒｏｓｓ，Ｒ．及びＲａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．「Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓｔｏｘｉｎｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ」，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ，１９９３，９０：３９１３－３９１７）。ＴＡＬＥＮＢ２Ｍ標的化ｈＥＳＣ株は、オフターゲット切断現象について試験されなかったが、ＴＡＬＥＮを使用する際の非特異的切断の発生は、それらの臨床使用に対して主要な安全性の懸念を強いると考えられる重大な問題のままである（Ｇｒａｕ，Ｊ．ｅｔａｌ．「ＴＡＬＥＮｏｆｆｅｒ：ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅＴＡＬＥＮｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ」，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１３，２９：２９３１－２９３２；ＧｕｉｌｉｎｇｅｒＪ．Ｐ．ｅｔａｌ．「ＢｒｏａｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆＴＡＬＥＮｓｒｅｓｕｌｔｓｉｎｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｎｕｃｌｅａｓｅｓｗｉｔｈｉｍｐｒｏｖｅｄＤＮＡ－ｃｌｅａｖａｇｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」，ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ２０１４，１１：４２９－４３５）。さらに、別の報告では、第１のＢ２Ｍアレルをノックアウトし、且つ第２のＢ２ＭアレルでＨＬＡ－Ｅ遺伝子をノックインして、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃの表面発現がない状態でＨＬＡ－Ｅの二量体又は三量体の表面発現をもたらすことによって、同種認識を回避したＩＰＳ細胞を作製した（Ｇｏｒｎａｌｕｓｓｅ，Ｇ．Ｇ．ｅｔａｌ．，「ＨＬＡ－Ｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｓｃａｐｅａｌｌｏｇｅｎｅｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｎｄｌｙｓｉｓｂｙＮＫｃｅｌｌｓ」，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３５，７６５－７７３）。
【０００６】
上記の戦略のうちの一部の潜在的な制約は、ＭＨＣクラスＩ陰性細胞が、ＨＬＡ分子がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する主要なリガンド阻害剤として機能するためナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって溶解されやすいことである。宿主ＮＫ細胞は、移植されたか又は生着されたＢ２Ｍ－／－ドナー細胞を除去することが示されており、同様の現象は、ＭＨＣクラスＩ陰性ヒト白血病株によりインビトロで発生する（Ｂｉｘ，Ｍ．ｅｔａｌ．，「ＲｅｊｅｃｔｉｏｎｏｆｃｌａｓｓＩＭＨＣ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｈａｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃｃｅｌｌｓｂｙｉｒｒａｄｉａｔｅｄＭＨＣ－ｍａｔｃｈｅｄｍｉｃｅ」，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３４９，３２９－３３１；Ｚａｒｃｏｎｅ，Ｄ．ｅｔａｌ．，「Ｈｕｍａｎｌｅｕｋｅｍｉａ－ｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌｌｌｉｎｅｓａｎｄｃｌｏｎｅｓａｓｍｏｄｅｌｓｆｏｒｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ」，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９８７，４７，２６７４－２６８２）。したがって、先行する方法を改善して免疫応答を回避できるユニバーサルドナー細胞を作製する必要性、及び生着後に生存できる細胞を作製する必要性が存在する。本明細書に記載されるとおり、生着後の細胞の生存は、同種拒絶に依存しない多くの他の経路、例えば、低酸素、活性酸素種、栄養欠乏、及び酸化ストレスによって媒介され得る。また、本明細書に記載されるとおり、生存因子（遺伝子及び／又はタンパク質）の遺伝的導入は、細胞が生着後に生存する助けとなり得る。本明細書に記載されるとおり、ユニバーサルドナー細胞株は、同種拒絶及び生着後の生存の両方に対処する特性を兼ね備え得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
いくつかの態様では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を作製する方法を包含する。第１の方法は、（ｉ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子のうちの１つ以上をコードする少なくとも１つの遺伝子内又は近傍の部位で細胞のゲノム中の少なくとも１つの塩基対の欠失及び／又は挿入を導入すること；並びに（ｉｉ）細胞のゲノムにおいて（ｉ）の部位に部分的に重複するか、完全に重複するか、又はその内部に含有される部位で免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの挿入を導入することによって、細胞を遺伝子改変し、それによりユニバーサルドナー細胞を作製することを含む。第２の方法は、（ｉ）ＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子のうちの１つ以上をコードする少なくとも１つの遺伝子内又は近傍の部位で細胞のゲノム中の少なくとも１つの塩基対の欠失及び／又は挿入を導入すること；並びに（ｉｉ）細胞のゲノムにおいてセーフハーバー座位に免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの挿入を導入することによって、細胞を遺伝子改変し、それによりユニバーサルドナー細胞を作製することを含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、未改変細胞と比較して免疫回避及び／又は細胞生存の増加を有する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原又はＭＨＣ－Ｉ若しくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成要素若しくは転写調節因子をコードする少なくとも１つの遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、若しくはＨＬＡ－Ｃから選択されるＭＨＣ－Ｉ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、若しくはＨＬＡ－ＤＲから選択されるＭＨＣ－ＩＩ遺伝子、又はＢ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、若しくはＲＦＸＡＮＫから選択される遺伝子である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４、又はＣＤ４７のうちの１つ以上をコードする１つ以上のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、外来プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、外来プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、又は細胞型特異的プロモーターであり、任意選択により、外来プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦｌａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、又はＵＢＣプロモーターである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、（ｉ）の欠失及び／又は挿入は、Ｂ２Ｍ内又は近傍にあり、（ｉｉ）の挿入は、ＰＤ－Ｌ１又はＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドである。
（【００１１】以降は省略されています）

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