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公開番号2024095297
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-07-10
出願番号2022212471
出願日2022-12-28
発明の名称2-インドールカルボン酸脱炭酸活性を有するポリペプチド及びその利用
出願人花王株式会社
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類C12N 15/60 20060101AFI20240703BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】2-インドールカルボン酸類の脱炭酸活性を有するポリペプチド及びその利用法を提供する。
【解決手段】配列番号2で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の322位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、又は配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2で示されるアミノ酸配列の322位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、インドール-2-カルボン酸脱炭酸活性を有するポリペプチド;
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、インドール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有するポリペプチド；
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、インドール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有する変異ポリペプチドの製造方法；
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン。
【請求項３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、インドール－２－カルボン酸に対する脱炭酸活性の付与方法；
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン。
【請求項４】
請求項１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
【請求項６】
フラビンモノヌクレオチドプレニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５記載のベクター又はＤＮＡ断片。
【請求項７】
請求項５又は６記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
【請求項８】
前記形質転換細胞又はその宿主がフラビンモノヌクレオチドプレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をさらに保有する、請求項７記載の形質転換細胞。
【請求項９】
細胞が大腸菌、酵母又はコリネ型細菌である、請求項７又は８記載の形質転換細胞。
【請求項１０】
下記の一般式（１）：
TIFF
2024095297000009.tif
36
170
〔式中、Ｒ
1
及びＲ
2
は同一又は異なっていてもよく、水素原子、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のアルコキシ基、カルボキシ基又はアミノ基を示す。〕
で表されるインドール－２－カルボン酸類を、請求項１記載のポリペプチド又は請求項７～９のいずれか１項記載の形質転換細胞と接触させる工程を含む、下記の一般式（２）：
TIFF
2024095297000010.tif
36
170
〔式中、Ｒ
1
及びＲ
2
は前記と同じものを示す。〕
で示されるインドール類の製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は２－インドールカルボン酸脱炭酸活性を有するポリペプチド及びその利用に関する。
続きを表示（約 2,500 文字）【背景技術】
【０００２】
インドールはベンゼン環とピロール環が縮合した構造をとる有機化合物であり、天然ジャスミン精油に約２．５％含まれ、合成インドールはオレンジやジャスミン系の香料や香水に使用されている。また、インドールはインディゴ色素の原料としても知られている。さらに、インドール環上に置換基を有するインドール類は、医薬品や各種化成品、それらの合成中間体としても重要である。
【０００３】
インドール類の合成は、Ｒｅｉｓｓｅｒｔ法、Ｆｉｓｃｈｅｒ法、Ｒｅｅｓ－Ｍｏｏｄｙ法などの合成法が古くから知られている。しかし、歴史あるこれらの方法を用いたインドール環の形成反応においては、反応性の点から２－インドールカルボン酸等のインドールカルボン酸を合成した後に脱炭酸する手法が採用される。例えば、フェニルヒドラジンとピルビン酸を用いて２－インドールカルボン酸を製造し、その後脱炭酸反応に付して、インドールを合成することが行われている。ここで行われる脱炭酸反応は、主に加熱条件下（２００～３００℃）で行われるため、生成物の分解と精製時の追加的な分解を引き起こすという問題があった（非特許文献１）。
【０００４】
一方、近年、常温常圧下で１段階かつ可逆的にヘテロ芳香族カルボン酸のカルボキシル基を脱離可能な酵素触媒として、ＰａＨｕｄＡ、ＣｂＨｍｆＦ、ＡｎＦＤＣ１等のプレニル化フラビン型デカルボキシラーゼ（ｐｒＦＭＮ－ＤＣ）が見出されている（非特許文献２）。このうち、代表的なｐｒＦＭＮ－ＤＣであるＡｎＦＤＣ１では多様な芳香族性基質への特異性改変が行われ、２－インドールカルボン酸に対して脱炭酸活性を有する変異体が見出されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
U. Tilstam, Organic Process Research & Development 2012, 16, 1449.
S. E. Payer et al., Advanced Synthesis & Catalysis 2019, 361, 2402.
D. Leys et al., Nature Chemical Biology 2020, 16, 1255.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、２－インドールカルボン酸類の脱炭酸活性を有するポリペプチド及びその利用法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ピロール－２－カルボン酸に対して脱炭酸活性を有するプレニル化フラビン型デカルボキシラーゼであるＰａＨｕｄＡの特定の変異体が、２－インドールカルボン酸に対して優れた脱炭酸活性を有し、インドール酸類の製造に有用であることを見出した。
【０００８】
本発明は以下の１）～７）に係るものである。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、インドール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有するポリペプチド；
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン。
２）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、インドール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有する変異ポリペプチドの製造方法；
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン。
３）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、インドール－２－カルボン酸に対する脱炭酸活性の付与方法；
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン。
４）１）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
５）４）のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
６）５）のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
７）下記の一般式（１）：
【０００９】
TIFF
2024095297000001.tif
34
170
〔式中、Ｒ
1
及びＲ
2
は同一又は異なっていてもよく、水素原子、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のアルコキシ基、カルボキシ基又はアミノ基を示す。〕
【００１０】
で表されるインドール－２－カルボン酸類を、１）のポリペプチド又は６）の形質転換細胞と接触させる工程を含む、下記の一般式（２）：
（【００１１】以降は省略されています）

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