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公開番号2025172162
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-11-20
出願番号2025151312,2021567657
出願日2025-09-11,2020-12-25
発明の名称翻訳用組成物及びペプチドの製造方法
出願人中外製薬株式会社
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/11 20060101AFI20251113BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】コドンの読み間違いにより意図しないアミノ酸が誤って翻訳されてしまう割合を低減することを可能とする新たな手段を提供することを課題の一つとする。
【解決手段】いくつかの態様において、本開示は、tRNAの32、33、37および38位(tRNAナンバリング則)に特定の塩基の組み合わせを有するtRNAを含む翻訳用組成物を提供する。本開示の特定の態様によれば、コドンの読み間違いによって意図しないアミノ酸が導入される割合を低減することができる。
【選択図】図1

特許請求の範囲【請求項１】
第一のアミノ酸が結合した第一のtRNAと、第二のアミノ酸が結合した第二のtRNAを含む翻訳用組成物であって、
前記第一のtRNAの 32、33、37及び38位（tRNAナンバリング則）の塩基の組み合わせが、
（１）32U、33U、37G、38A、
（２）32A、33U、37G、38U、
（３）32A、33U、37A、38U、
（４）32U、33U、37G、38U、
（５）32U、33U、37A、38U、又は
（６）32C、33U、37G、38A、
であり、
前記第一のtRNA及び前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基が互いに異なり、
前記第一のtRNA及び前記第二のtRNAのアンチコドンの２文字目の塩基が同一であり、
前記第一のtRNA及び前記第二のtRNAのアンチコドンの３文字目の塩基が同一であり、
前記第一のアミノ酸及び前記第二のアミノ酸から選択される少なくとも一つが非天然アミノ酸であり、
ここで、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Uはウラシルである、
前記組成物。
続きを表示（約 1,300 文字）【請求項２】
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＡ又はＧであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＣ又はＵであるか、
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＣ又はＵであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＡ又はＧである、
請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第一及び前記第二のtRNAのアンチコドンの２文字目及び３文字目の塩基の組み合わせが、
(i) ２文字目にＧ、かつ３文字目にＧ、
(ii) ２文字目にＡ、かつ３文字目にＧ、
(iii) ２文字目にＣ、かつ３文字目にＣ、
(iv) ２文字目にＧ、かつ３文字目にＣ、
(v) ２文字目にＡ、かつ３文字目にＣ、
(vi) ２文字目にＧ、かつ３文字目にＵ、
(vii) ２文字目にＧ、かつ３文字目にＡ、又は
(viii) ２文字目にＣ、かつ３文字目にＧ、
である、請求項１又２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第一のtRNAのtRNAボディがキメラtRNAボディである、請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
無細胞翻訳用組成物である、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記キメラtRNAボディが、32、33、37および38位（tRNAナンバリング則）の塩基と、それ以外の部位の塩基配列の由来が異なるキメラtRNAボディである、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記第一のtRNAが人工tRNAである、請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
請求項１～７のいずれかに記載の組成物（但し、前記第一のtRNA及び前記第二のtRNAが32、33、37及び38位（tRNAナンバリング則）に請求項１の（４）において特定される塩基を有し、1～31位及び39～74位（tRNAナンバリング則）において配列番号：255に記載の塩基配列を有するtRNAにおける1～31位及び39～74位（tRNAナンバリング則）の塩基配列を有するキメラtRNAボディを有する場合において、前記第一のtRNA及び前記第二のtRNAのアンチコドンの組み合わせが、ＧＣＧ及びＣＣＧである組成物、並びに、ＣＣＧ及びＧＣＧである組成物を除く）。
【請求項９】
前記第一のtRNAがキメラアンチコドンループを有するtRNAである、請求項１～８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記第一のtRNAの32、33、37及び38位（tRNAナンバリング則）の塩基の組み合わせが、
（１）32U、33U、37G、38A、
（２）32A、33U、37G、38U、
（３）32A、33U、37A、38U、又は
（４）32U、33U、37G、38U、
である、請求項１～９のいずれかに記載の組成物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、翻訳用組成物及びペプチドの製造方法に関する。
続きを表示（約 7,600 文字）【背景技術】
【０００２】
タンパク質翻訳に関わる因子のみを混ぜ合わせることで人工的に再構成した無細胞翻訳系（非特許文献1）は、生命現象の解明から新薬開発に至るまで幅広い領域で利用されている。無細胞翻訳系は微生物や細胞を使用しないため、毒性の高いタンパク質の合成に利用することが出来る。またアミノ酸、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素といった構成成分を目的に合わせて除去又は添加出来るため、コドンとアミノ酸の対応付けを変更すること（遺伝暗号のリプログラミング）も可能である。こうした特徴から、無細胞翻訳系は非天然アミノ酸含有タンパク質の合成や多様なビルディングブロックを導入したディスプレイライブラリーの構築にも応用されている。このように無細胞翻訳系は非常に有用な技術であるが、コドンの読み間違いによって意図していないペプチドが生み出されることがある。例えば、RF1を不活化させ、アンバーコドン（UAG）に非天然アミノ酸を割り当てたときに、同コドンに対して一定の割合でチロシン（UAU、UAC）、リシン（AAG）、グルタミン（GAG）が誤って導入されたことが報告されている（非特許文献2）。
【０００３】
コドンボックスを人工的に分割し、遺伝暗号のリプログラミングを行った例が報告されている。非特許文献3では、C-G-C/G、G-U-C/G及びG-G-C/Gに対して、１つの非天然アミノ酸と１つの天然アミノ酸を割り当てる試みがされている。同文献には、Glyが結合したtRNA
Gly
CCC
によるGGCコドンの読み間違いの低減策として、GGCと相補的なアンチコドンGCCを有し且つアミノ酸がプレチャージされたtRNAが枯渇する前に翻訳反応を停止することが記載されているが、どのような翻訳用組成物であればコドンの読み間違いを低減できるのかは記載されていない。また、非特許文献4～7、特許文献1及び2でも、コドンボックスを人工的に分割する試みがされているが、コドンの読み間違いを低減する方法についての記載はない。
【０００４】
tRNAのアンチコドンループに位置する32及び38位には、アンチコドンのトリプレットごとに特定の塩基が保存されていることが知られている。アンチコドンGGCを有するtRNA(Ala)
GGC
を用いた報告によると、32及び38位に天然のtRNA(Ala)
GGC
で保存されている塩基を用いた場合には、GUCコドンの読み間違いが起こりにくく、一方、32及び38位の塩基を変更した場合には、同tRNAによるGUCコドンの読み間違いが生じ、誤ってアラニン（GCC）が翻訳導入されたことが示されている（非特許文献8）。同文献は、天然の遺伝暗号表を用いた、tRNA(Ala)
GGC
によるGUCコドンの読み間違いの検証にとどまり、遺伝暗号表をリプログラミングした際に生じ得るコドンの読み間違いについての記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
WO2019/139126
WO2012/026566
【非特許文献】
【０００６】
Shimizu et al., Nat Biotechnol. 2001 Aug;19(8): 751-755.
Gan et al., Biochem. Biophys. Acta, 2017Dec; 1861; 3047-3052.
Iwane et al., Method Mol. Biol., 2018,1728, 17-47.
Passioura et al., J Am. Chem. Soc., 2018,140, 11551-11555.
Passioura et al., Cell Chem. Biol., 2018,25, 906-915.
Iwane et al., Nat. Chem., 2016, 8,317-325.
Azusa et al., Peptide Science 2009, 2010Mar; 17-18.
Murakami et al., Nat. Struct. Mol. Biol.,2009 Mar; 16; 353-358.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、tRNAによるコドンの読み間違いに起因して意図しないアミノ酸が誤って翻訳されてしまう割合を低減することを可能とする翻訳用組成物及び該翻訳用組成物を用いたペプチドの製造方法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、翻訳に使用するtRNAのアンチコドンループに特定の塩基を選択することにより、上記課題を解決できることを見出した。本開示はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下に例示的に記載する実施態様を包含するものである。
〔１〕第一のアミノ酸が結合した第一のtRNAと、第二のアミノ酸が結合した第二のtRNAを含む翻訳用組成物であって、
前記第一のtRNAの 32、33、37及び38位（tRNAナンバリング則）の塩基の組み合わせが、
（１）32U、33U、37G、38A、
（２）32A、33U、37G、38U、
（３）32A、33U、37A、38U、
（４）32U、33U、37G、38U、
（５）32U、33U、37A、38U、又は
（６）32C、33U、37G、38A、
であり、
前記第一のtRNA及び前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基が互いに異なり、
前記第一のtRNA及び前記第二のtRNAのアンチコドンの２文字目の塩基が同一であり、
前記第一のtRNA及び前記第二のtRNAのアンチコドンの３文字目の塩基が同一であり、
前記第一のアミノ酸及び前記第二のアミノ酸の少なくとも一つが非天然アミノ酸であり、
ここで、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Uはウラシルである、
前記組成物。
〔２〕前記第一のtRNAのアンチコドンがN
11
N
12
N
13
（ここで、N
11
、N
12
、及びN
13
は、互いに独立してA、C、G又はUである）である、〔１〕に記載の組成物。
〔３〕前記第二のtRNAのアンチコドンがN
21
N
22
N
23
（ここで、N
21
、N
22
、及びN
23
は、互いに独立してA、C、G又はUである）である、〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔４〕前記第一のtRNAのtRNAボディがキメラtRNAボディである、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の組成物。
〔５〕前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＡ又はＧであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＣ又はＵであるか、
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＣ又はＵであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＡ又はＧである、
〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の組成物。
〔６〕前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＡ又はＧであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＣ又はＵである、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の組成物。
〔７〕前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＡであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＣであるか、
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＣであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＡであるか、
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＧであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＣであるか、
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＣであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＧであるか、
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＡであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＵであるか、
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＵであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＡであるか、
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＧであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＵであるか、又は
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＵであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＧである、
〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の組成物。
〔８〕前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＡであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＣであるか、
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＣであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＡであるか、
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＡであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＵであるか、
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＵであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＡであるか、
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＧであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＵであるか、又は
前記第一のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＵであって、前記第二のtRNAのアンチコドンの１文字目の塩基がＧである、
【０００９】
〔Ａ１〕〔１〕～〔８５〕のいずれかに記載の翻訳用組成物または〔８６〕～〔８９〕のいずれかに記載の方法によって製造された翻訳用組成物を用いて核酸を翻訳することを含む、ペプチドの製造方法。
〔Ａ２〕〔１〕～〔８５〕のいずれかに記載の翻訳用組成物または〔８６〕～〔８９〕のいずれかに記載の方法によって製造された翻訳用組成物を用いて核酸を翻訳することを含む、前記第一のtRNAによる、前記第二のtRNAのアンチコドンに相補的なコドンの読み間違いを低減する方法。
〔Ａ３〕前記核酸が、前記第二のtRNAのアンチコドンに相補的なコドンを有するｍＲＮＡである、〔Ａ１〕又は〔Ａ２〕に記載の方法。
〔Ａ４〕前記核酸が、前記第一のtRNAのアンチコドンに相補的なコドンを有するｍＲＮＡであり、任意で、前記第一のtRNAのアンチコドンに相補的なコドン及び前記第二のtRNAのアンチコドンに相補的なコドンは、同一のｍＲＮＡに含まれていても、異なるｍＲＮＡに含まれていてもよい、〔Ａ３〕に記載の方法。
〔Ａ５〕前記核酸が含まれる核酸ライブラリーを翻訳してペプチドライブラリーを得ることを含む、〔Ａ１〕～〔Ａ４〕のいずれかに記載の方法。
〔Ａ６〕前記第一のtRNAのアンチコドンに相補的なコドンが、該アンチコドンと３塩基すべてにおいてワトソン－クリック型塩基対を形成するコドンである、〔Ａ１〕～〔Ａ５〕のいずれかに記載の方法。
〔Ａ７〕前記第二のtRNAのアンチコドンに相補的なコドンが、該アンチコドンと３塩基すべてにおいてワトソン－クリック型塩基対を形成するコドンである、〔Ａ１〕～〔Ａ６〕のいずれかに記載の方法。
〔Ａ８〕前記第一のtRNAのアンチコドンに相補的なコドンの３文字目が、該アンチコドンの１文字目とwobble塩基対を形成する、〔Ａ１〕～〔Ａ５〕のいずれかに記載の方法。
〔Ａ９〕前記第二のtRNAのアンチコドンに相補的なコドンの３文字目が、該アンチコドンの１文字目とwobble塩基対を形成する、〔Ａ１〕～〔Ａ６〕または〔Ａ８〕のいずれかに記載の方法。
〔Ａ１０〕前記核酸がmRNAである、〔Ａ１〕～〔Ａ９〕のいずれかに記載の方法。
〔Ａ１１〕〔Ａ１〕～〔Ａ１０〕のいずれかに記載の方法によって製造されたペプチドまたはペプチドライブラリー。
〔Ａ１２〕〔１〕～〔８５〕のいずれかに記載の翻訳用組成物または〔８６〕～〔８９〕のいずれかに記載の方法によって製造された翻訳用組成物を用いて製造されたペプチド。
〔Ａ１３〕〔１〕～〔８５〕のいずれかに記載の翻訳用組成物または〔８６〕～〔８９〕のいずれかに記載の方法によって製造された翻訳用組成物を用いて製造されたペプチドライブラリー。
〔Ａ１４〕〔Ａ１〕～〔Ａ１０〕のいずれかに記載の方法を用いてペプチドライブラリーを製造する工程、及び、該ペプチドライブラリーに標的分子を接触させる工程を含む、該標的分子に結合するペプチドの同定方法。
【００１０】
〔Ｂ１〕第一のコドンと相補的なアンチコドンを有するtRNAの32、33、37及び38位（tRNAナンバリング則）からなる群より選択される少なくとも１つの塩基を置換することを含む、前記tRNAによる第二のコドンの読み間違いを低減する方法であって、
前記第一のコドンと前記第二のコドンの一文字目は同じ塩基であり、
前記第一のコドンと前記第二のコドンの二文字目は同じ塩基であり、
前記第一のコドンと前記第二のコドンの三文字目は互いに異なる塩基である、前記方法。
〔Ｂ２〕前記置換後の32、33、37及び38位（tRNAナンバリング則）の塩基の組み合わせが、
（１）32U、33U、37G、38A、
（２）32A、33U、37G、38U、
（３）32A、33U、37A、38U、
（４）32U、33U、37G、38U、
（５）32U、33U、37A、38U、又は
（６）32C、33U、37G、38A、
であり、ここで、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Uはウラシルである、〔Ｂ１〕に記載の方法。
〔Ｂ３〕前記第一のコドンと相補的なアンチコドンを有するtRNAの32、37及び38位（tRNAナンバリング則）からなる群より選択される少なくとも１つの塩基を置換することを含む、〔Ｂ１〕又は〔Ｂ２〕に記載の方法。
〔Ｂ４〕前記第一のコドンがM
1
M
2
Xであり、前記第二のコドンがM
1
M
2
Yであって、
前記M
1
及び前記M
2
はそれぞれ独立してA、C、G又はUであり、
前記X及び前記YはそれぞれA、C、G及びUから選択される、互いに異なる塩基である、〔Ｂ１〕～〔Ｂ３〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｂ５〕前記X及び前記Yの塩基の組み合わせが、以下の群より選択されるいずれかである、〔Ｂ４〕に記載の方法：
(a1) UとG；(a2) GとU；(a3) UとA；(a4) AとU；(a5) CとA；(a6) AとC；(a7) CとG；及び (a8) GとC。
〔Ｂ６〕前記X及び前記Yの塩基の組み合わせが、以下の群より選択されるいずれかである〔Ｂ４〕又は〔Ｂ５〕に記載の方法：
(a1) UとG；(a2) GとU；(a3) UとA；(a5) CとA；及び (a7) CとG。
〔Ｂ７〕前記X及び前記Yの塩基の組み合わせが、(a1)UとG、又は、(a2) GとUである、〔Ｂ５〕に記載の方法。
〔Ｂ８〕前記X及び前記Yの塩基の組み合わせが(a1)UとGである、〔Ｂ５〕～〔Ｂ７〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｂ９〕前記X及び前記Yの塩基の組み合わせが(a2)GとUである、〔Ｂ５〕～〔Ｂ７〕のいずれかに記載の方法。
〔Ｂ１０〕前記X及び前記Yの塩基の組み合わせが(a3)UとAである、〔Ｂ５〕又は〔Ｂ６〕に記載の方法。
〔Ｂ１１〕前記X及び前記Yの塩基の組み合わせが(a5)CとAである、〔Ｂ５〕又は〔Ｂ６〕に記載の方法。
〔Ｂ１２〕前記X及び前記Yの塩基の組み合わせが(a7)CとGである、〔Ｂ５〕又は〔Ｂ６〕に記載の方法。
〔Ｂ１３〕前記M
1
M
2
が、以下の群より選択されるいずれかの塩基配列である、〔Ｂ４〕～〔Ｂ１２〕のいずれかに記載の方法：
(b1) CC；(b2) CU；(b3)GG；(b4) GU；(b5) GC；(b6) UC；(b7) CG；及び(b8) AC。
〔Ｂ１４〕前記M
1
M
2
が、以下の群より選択されるいずれかの塩基配列である〔Ｂ１３〕に記載の方法：
(b1) CC；(b2) CU；及び(b3) GG。
〔Ｂ１５〕前記M
1
M
2
の塩基配列が (b1) CCである、〔Ｂ１３〕又は〔Ｂ１４〕に記載の方法。
〔Ｂ１６〕前記M
1
M
2
の塩基配列が (b2) CUである、〔Ｂ１３〕又は〔Ｂ１４〕に記載の方法。
〔Ｂ１７〕前記M
1
M
2
の塩基配列が (b3) GGである、〔Ｂ１３〕又は〔Ｂ１４〕に記載の方法。
〔Ｂ１８〕前記第一のコドンと前記tRNAのアンチコドンとが、３塩基すべてにおいてワトソン－クリック型塩基対を形成する、〔Ｂ１〕～〔Ｂ１７〕のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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