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公開番号2025142446
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-01
出願番号2024038273
出願日2024-03-12
発明の名称トビイロウンカの抗菌ペプチドの発現を阻害する阻害剤とその応用
出願人中国計量大学
代理人個人,個人
主分類C12N 15/11 20060101AFI20250924BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】トビイロウンカにおける抗菌ペプチドの発現を阻害する阻害剤とその応用を提供する。
【解決手段】トビイロウンカのNlPCE4遺伝子に基づいて設計したdsNlPCE4阻害剤を得、前記阻害剤はメタリジウムアニソプリエ(Metarhizium anisopliae)を体表接種したトビイロウンカに適用することによりトビイロウンカの死亡率が大幅に増加する。本発明は、生物防除菌類とRNAiという2つの害虫防除の技術的方策を組み合わせ、RNA干渉(RNAi)の共同媒介に基づくトビイロウンカ防除技術の新たな標的を提供する。
【選択図】図5
特許請求の範囲【請求項１】
トビイロウンカＮ１ＰＣＥ４遺伝子に従って設計された二本鎖ＲＮＡであり、
前記トビイロウンカＮ１ＰＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡ配列はＳＥＱＮｏＩＤ：０１であり、コードされたタンパク質配列はＳＥＱＮｏＩＤ：０２であることを特徴とするトビイロウンカの抗菌ペプチドの発現を阻害する阻害剤。
続きを表示（約 890 文字）【請求項２】
前記トビイロウンカＮｌＰＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡ配列が遺伝子クローニングにより得られ、ＮｌＰＣＥ４遺伝子クローニングのプライマーがｃＰＣＥ４－ＦＳＥＱＮｏＩＤ：４、及びｃＰＣＥ４－ＲＳＥＱＮｏＩＤ：５であり、
前記阻害剤は、トビイロウンカの４つの抗菌ペプチドをコードする遺伝子ＤｅｆｅｎｓｉｎＡ、ＤｅｆｅｎｓｉｎＢ、ＬｕｇｅｎｓｉｎＡ、およびＬｕｇｅｎｓｉｎＢの発現量を大幅に減少させることができるｄｓＮｌＰＣＥ４であり、
前記ｄｓＮｌＰＣＥ４は、ＮｌＰＣＥ４のｃＤＮＡ配列に基づいて設計されたｄｓＲＮＡ合成プライマーによって合成され、
前記ｄｓＲＮＡ合成プライマーは、ｄｓＮｌＰＣＥ４－ＦＳＥＱＮｏＩＤ：１０およびｄｓＮｌＰＣＥ４－ＲＳＥＱＮｏＩＤ：１１であり、ｄｓＮｌＰＣＥ４配列はＳＥＱＩＤＮｏ：０３であることを特徴とする請求項１に記載のトビイロウンカの抗菌ペプチドの発現を阻害する阻害剤。
【請求項３】
トビイロウンカの生存率を低下させるために使用されるトビイロウンカの抗菌ペプチドの発現を阻害する阻害剤の応用であって、
前記阻害剤はトビイロウンカのＮ１ＰＣＥ４遺伝子に従って設計された二本鎖ＲＮＡであり、
前記トビイロウンカＮ１ＰＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡ配列はＳＥＱＮｏＩＤ：０１であり、コードされたタンパク質配列はＳＥＱＮｏＩＤ：０２であることを特徴するトビイロウンカの抗菌ペプチドの発現を阻害する阻害剤の応用。
【請求項４】
前記阻害剤はトビイロウンカに対する生物防除菌類の殺虫効率を向上させるために使用され、または、生物防除真菌を体表接種されたトビイロウンカに作用するために使用され、
前記生物防除真菌はメタリジウムアニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）Ｍａ４５６菌株であることを特徴とする請求項３に記載のトビイロウンカの抗菌ペプチドの発現を阻害する阻害剤の応用。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の分野、特にトビイロウンカにおける抗菌ペプチドの発現を阻害する阻害剤およびその応用に関する。
続きを表示（約 2,100 文字）【背景技術】
【０００２】
トビイロウンカは我が国では稲の重要な害虫であり、稲の樹液を吸い取り、産卵し、ウイルス性疾患を媒介することで被害をもたらし、稲の品質と収量に深刻な影響を与える。現在トビイロウンカを防除する主な方法は、化学殺虫剤の使用である。しかし、化学殺虫剤の継続的かつ不合理な使用は、深刻な「３Ｒ」問題（薬物耐性、再蔓延、残留農薬）を引き起こす可能性がある。トビイロウンカの生物学的防除には微生物による防除が推奨されているが、その中でも生物防除菌類は、その独特の体壁接触感染様式により、刺吸い口器害虫の防除に明らかな利点を持っている。メタリジウムアニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）は生物防除菌類の典型的な代表として、トビイロウンカの防除に大きな応用可能性が実証されている。
【０００３】
自然条件下では、メタリジウムアニソプリエによる宿主感染プロセスは、宿主の体壁への分生子付着から始まり、発芽して宿主の体壁を貫通して血腔に侵入し、宿主の免疫防御システムを突破した後、血腔の栄養素が枯渇するまで急速に増殖し、最終的には宿主を死に至らしめる。明らかに、宿主昆虫の免疫防御反応を克服することは、メタリジウムアニソプリエの殺虫効率にとって重要な前提条件である。既存の研究では、昆虫の免疫システムを人為的に抑制すると、標的害虫に対する生物防除菌類の殺虫効率が大幅に向上する可能性があることが示されている。菌類と昆虫の相互作用における宿主の免疫調節関連遺伝子の発見と利用は、トビイロウンカ用の効率的な真菌系殺虫剤の開発における重要な基盤であり、重要なつながりである。
【０００４】
ＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡを用いて標的遺伝子の発現を効率的かつ特異的に阻害する技術であり、害虫防除研究の分野で広く利用されている。人工合成ｄｓＲＮＡによる害虫の成長と発達、または重要な行動に影響を与える重要な遺伝子を標的としてサイレンシングすると、昆虫の個体数を効果的に減らし、害虫の予防と防除効果を達成できる。生物防除菌類とＲＮＡｉ技術を組み合わせると、標的害虫の防除に相乗効果をもたらすことができる。上記の組み合わせ技術の中核は、効率的な標的遺伝子のスクリーニングである。
【０００５】
プロクロッティング酵素（Ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ，ＰＣＥ）は、広範囲に昆虫や他の節足動物の体内に存在し、Ｃｌｉｐドメインを含む多様な機能を持つセリンプロテアーゼの一種である。活性化後は、プロテアーゼ加水分解カスケード反応を媒介することにより、昆虫の成長と発達、免疫防御などの多くの生理学的プロセスを調節でき、害虫駆除の効果的な潜在的標的となる。
本発明は、生物防除菌類とＲＮＡｉという２つの害虫防除方策を組み合わせてトビイロウンカの死亡率を大幅に増加させ、このような問題を解決するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
既存の技術の欠陥を解決するために、本発明の目的は、トビイロウンカにおける抗菌ペプチドの発現を阻害する阻害剤およびその応用を提供することであり、本発明は、トビイロウンカのＮｌＰＣＥ４遺伝子に基づいて設計したｄｓＮｌＰＣＥ４阻害剤を得、この阻害剤がメタリジウムアニソプリエにより体表接種されたトビイロウンカに対して作用することで、トビイロウンカの死亡率を顕著に増加させることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決策を採用する。
トビイロウンカの抗菌ペプチドの発現を阻害する阻害剤であって、トビイロウンカのＮｌＰＣＥ４遺伝子に基づいて設計された二本鎖ＲＮＡであり、トビイロウンカのＮｌＰＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡ配列はＳＥＱＮｏＩＤ：０１であり、コードされたタンパク質配列はＳＥＱＮｏＩＤ：０２である。
【０００８】
上記のトビイロウンカの抗菌ペプチドの発現を阻害する阻害剤は、遺伝子クローニングによりトビイロウンカのＮｌＰＣＥ４遺伝子のｃＤＮＡ配列を取得し、ＮｌＰＣＥ４遺伝子をクローニングするためのプライマーはｃＰＣＥ４－ＦＳＥＱＮｏＩＤ：４及びｃＰＣＥ４－ＲＳＥＱＮｏＩＤ：５である。
【０００９】
上記のトビイロウンカの抗菌ペプチドの発現を阻害する阻害剤は、ｄｓＮｌＰＣＥ４であり、トビイロウンカの４つの抗菌ペプチドをコードする遺伝子、ＤｅｆｅｎｓｉｎＡ、ＤｅｆｅｎｓｉｎＢ、ＬｕｇｅｎｓｉｎＡ、およびＬｕｇｅｎｓｉｎＢの発現量を大幅に低下させることができる。
【００１０】
上記のトビイロウンカの抗菌ペプチドの発現を阻害する阻害剤、ｄｓＮｌＰＣＥ４は、ＮｌＰＣＥ４のｃＤＮＡ配列からｄｓＲＮＡ合成プライマーを設計することによって合成される。
（【００１１】以降は省略されています）

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