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公開番号2025134890
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-09-17
出願番号2025105215,2022194566
出願日2025-06-23,2012-12-07
発明の名称単一ホルモンのインスリン陽性細胞へのヒト胚性幹細胞の分化
出願人ヤンセンバイオテツク,インコーポレーテツド
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/071 20100101AFI20250909BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】多能性幹細胞から分化した単一ホルモンのインスリン産生細胞、および分化のためのインビトロの方法を提供する。
【解決手段】多能性細胞の段階的分化から得られる、膵臓内胚葉細胞のインビトロ分化集団であって、分化の各段階の細胞が、5mM～20mMのグルコースを含む培地中で培養される、膵臓内胚葉細胞の分化集団が提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
多能性細胞の段階的分化から得られる、膵臓内胚葉細胞のインビトロ分化集団であって
、分化の各段階の細胞が、５ｍＭ～２０ｍＭのグルコースを含む培地中で培養される、膵
臓内胚葉細胞の分化集団。
続きを表示（約 950 文字）【請求項２】
前記分化された膵臓内胚葉細胞の３０％超が、ＰＤＸ－１＋ＮＫＸ６．１＋、ＳＯＸ２
－、及びＣＤＸ２－である、請求項１に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
【請求項３】
前記分化集団の細胞の１０％超が単一ホルモンのインスリン陽性細胞である、請求項１
又は２に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
【請求項４】
前記段階的分化が、未分化のヒト胚性幹細胞をＴＧＦ－Ｂリガンドが更に追補された培
地中で培養する工程を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分化
集団。
【請求項５】
前記段階的分化が、未分化のヒト胚性幹細胞をＷＮＴ活性化剤が更に追補された培地中
で培養する工程を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団
。
【請求項６】
前記段階的分化が、胚体内胚葉細胞をＦＧＦリガンドが更に追補された培地中で培養す
る工程を含む、請求項１に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
【請求項７】
前記段階的分化が、ｓｈｈ阻害剤、ＦＧＦリガンド、ＰＫＣ活性化剤、ＴＧＦ－Ｂリガ
ンド、レチノイド、及びＢＭＰ阻害剤の勾配が更に追補された培地中で腸管細胞を培養す
る工程を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
【請求項８】
前記段階的分化が、ＰＫＣ活性化剤、ｓｈｈ阻害剤、レチノイド、及びＢＭＰ阻害剤が
更に追補された培地中で後方前腸細胞を培養する工程を含む、請求項５に記載の膵臓内胚
葉細胞の分化集団。
【請求項９】
前記段階的分化が、アスコルビン酸が更に追補された培地中で細胞を培養する工程を含
む、請求項１～６のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
【請求項１０】
膵臓内胚葉系統の細胞の集団への多能性細胞の段階的分化のためのインビトロの方法で
あって、５ｍＭ～２０ｍＭのグルコースを含む培地中での分化の各段階で細胞を培養する
工程を含む、方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年１２月２２日に出願された、米国特許仮出願第６１／５７９，３
５１号の利益を主張するものであり、当該出願を、本明細書にその全容において、かつあ
らゆる目的について援用するものである。
続きを表示（約 2,600 文字）【０００２】
（発明の分野）
本発明は、細胞分化の分野にある。より具体的には、本発明は、段階的分化の各工程で
定義された条件を用いて、多能性幹細胞から分化した単一ホルモンのインスリン産生細胞
を提供する。その集団において分化したインスリン産生細胞の１０％以上は、単一ホルモ
ンの膵臓β細胞に特徴的なマーカーを発現する。
【背景技術】
【０００３】
Ｉ型糖尿病の細胞置換療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着
に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つ
の手法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成する
ことがある。
【０００４】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つ
の胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺
、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。こ
のプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞（defini
tive endoderm cell）は、ＨＮＦ３β、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＣＸＣＲ４、及びＳＯ
Ｘ１７などの多数のマーカーを発現する。
【０００５】
原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前部、中間、及び後部の領域を特異的にマ
ークする因子のパネルの発現によって認識することができる前部－後部ドメインに分割さ
れる。例えば、Ｈｈｅｘ及びＳｏｘ２は内胚葉の前領域を特定し、Ｃｄｘ１、２及び４は
後半分を特定する。
【０００６】
内胚葉組織の移行は、内胚葉を腸管の領域化に役立つ異なった中胚葉組織に近接させる
。これは、例えば、ＦＧＦ、Ｗｎｔ、ＴＧＦ－Ｂ、レチノイン酸（ＲＡ）、及びＢＭＰリ
ガンド、並びにそれらのアンタゴニストのような多数の分泌された因子によって達成され
る。例えば、ＦＧＦ４及びＢＭＰは推定後腸内胚葉においてＣｄｘ２の発現を促進し、前
方の遺伝子Ｈｈｅｘ及びＳＯＸ２の発現を阻害する（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ２０００
，１２７：１５６３～１５６７）。ＷＮＴシグナル伝達はまた、後腸の発達を促進し、前
腸の運命を阻害するために、ＦＧＦシグナル伝達と平行して作用することが示されている
（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ２００７，１３４：２２０７～２２１７）。最後に、間葉に
よって分泌されるレチノイン酸は、前腸－後腸の境界を調節する（ＣｕｒｒＢｉｏｌ
２００２，１２：１２１５～１２２０）。
【０００７】
特異的転写因子の発現レベルは、組織のアイデンティティを指定するために使用できる
可能性がある。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現パ
ターンにより分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。例えば、
腸管で領域化された膵臓ドメインは、ＰＤＸ－１の非常に高い発現及びＣＤＸ２並びにＳ
ＯＸ２の非常に低い発現を示す。同様に、Ｆｏｘｅ１の高レベルの存在は、食道組織の指
標である。肺組織において高度に発現されるのはＮＫＸ２．１である。ＳＯＸ２／Ｏｄｄ
１（ＯＳＲ１）は胃組織において高度に発現される。ＰＲＯＸ１／Ｈｈｅｘ／ＡＦＰの発
現は肝組織において高い。ＳＯＸ１７は胆管構造の組織で高度に発現される。ＰＤＸ１、
ＮＫＸ６．１／ＰＴｆ１ａ、及びＮＫＸ２．２は膵臓組織において高度に発現される。Ｃ
ＤＸ２の発現は、腸組織において高い。上記要約は、ＤｅｖＤｙｎ２００９，２３８
：２９～４２及びＡｎｎｕＲｅｖＣｅｌｌＤｅｖＢｉｏｌ２００９，２５：２
２１～２５１からの引用である。
【０００８】
膵臓の形成は、膵臓内胚葉への胚体内胚葉の分化から生じる（ＡｎｎｕＲｅｖＣｅ
ｌｌＤｅｖＢｉｏｌ２００９，２５：２２１～２５１；ＤｅｖＤｙｎ２００９
，２３８：２９～４２）。背側と腹側の膵臓ドメインは、前腸上皮から生じる。また、前
腸は、食道、気管、肺、甲状腺、胃、肝臓、膵臓、胆管系を生じさせる。
【０００９】
膵臓内胚葉の細胞は膵臓－十二指腸ホメオボックス遺伝子ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ
１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって
、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を印している。成熟した膵臓は、
他の細胞型の中でも、外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、
膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【００１０】
Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚性幹細胞由来
の胚体内胚葉の濃縮培地の生産を記述している（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
２００５，２３：１５３４～１５４１；Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．７，７０４，７３
８）。マウスの腎臓被膜下でのこれらの細胞の移植は、内胚葉組織の特徴を有する、より
成熟した細胞への分化をもたらした（米国特許第７，７０４，７３８号）。ヒト胚性幹細
胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ－１０及びレチノイン酸の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞
に更に分化することができる（米国特許公開第２００５／０２６６５５４Ａ１号）。免疫
不全マウスの腎臓被膜下でのこれらの膵臓前駆細胞のその後の移植は、３～４ヶ月の成熟
期の後に、機能的膵内分泌細胞の形成をもたらした（米国特許第７，９９３，９２０号及
び米国特許第７，５３４，６０８号）。
（【００１１】以降は省略されています）

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