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公開番号2025134816
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-09-17
出願番号2025100116,2022546022
出願日2025-06-16,2021-01-29
発明の名称脆弱X症候群AGG中断の遺伝子型決定
出願人ラボラトリーコーポレイションオブアメリカホールディングス
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/686 20180101AFI20250909BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】脆弱X症候群(FXS)臨床試験を提供し、特に、臨床試験への実施のためのFXS AGG中断ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイ及びAGG中断遺伝子型決定アルゴリズムを提供する。
【解決手段】AGG遺伝子型決定方法は、試料に対して行われたFXSアッセイから生データを取得し、生データを反復的に探索し、予想AGGピークサイズに基づいて決定した探索空間の第1のセットを使用して第1の対立遺伝子上の1またはそれを超えるAGGピークを同定し、1またはそれを超えるAGGピークに基づいて、最後のAGG中断の下流のCGGリピートの数および第1の対立遺伝子上の最初のAGG中断に先行するCGGリピートの数を決定し、最後のAGG中断の下流のCGGリピートの数および最初のAGG中断に先行するCGGリピートの数に基づいて、第1の対立遺伝子のAGG遺伝子型を生成する。
【選択図】図3
特許請求の範囲【請求項１】
脆弱Ｘ（ＦＲＡＸ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生データを得るために、脆弱Ｘ（ＦＲＡＸ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを使用して対象から得られた試料をアッセイすることであって、前記試料が核酸を含み、前記ＦＲＡＸＰＣＲアッセイが、ＣＧＧリピートと、３’末端に「Ａ」ヌクレオチドとの両方を含むプライマー、およびリバースプライマーを利用する、こと、を含む方法。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
前記アッセイすることが、
前記試料に対して遺伝子特異的（ＧＳ）ＰＣＲおよびＡＧＧ中断ＰＣＲ（ＡＧＧＰＣＲ）を行い、ＰＣＲ産物を得ること；ならびに
キャピラリー電気泳動または高分離ゲルを使用して前記ＰＣＲ産物を分離し、前記ＦＲＡＸＰＣＲ生データを得ること、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＦＲＡＸＰＣＲアッセイの少なくとも１つのプライマーが、蛍光タグで標識され、
前記ＰＣＲ産物がキャピラリー電気泳動を使用して分離され、前記キャピラリー電気泳動が、ポリマーを通って移動する前記ＰＣＲ産物と、前記蛍光タグで標識された前記少なくとも１つのプライマー由来の、測定される蛍光発光と、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アッセイすることが、ＰＣＲ伸長中に標識塩基を添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＦＲＡＸＰＣＲアッセイが、ＦＭＲ１遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）のＣＧＧリピート領域を標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
試料のバッチを得ることをさらに含み、試料の前記バッチが、前記ＦＲＡＸＰＣＲアッセイを使用して同時にアッセイされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試料の前記バッチが、複数のウェルアッセイプレートを使用してアッセイされる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＦＲＡＸＰＣＲアッセイが、遺伝子特異的（ＧＳ）ＰＣＲおよびＡＧＧ中断ＰＣＲ（ＡＧＧＰＣＲ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アッセイすることが、
前記試料を希釈すること；
前記希釈された試料を、前記ＧＳＰＣＲおよび前記ＡＧＧＰＣＲのために試薬およびプライマーと混合することであって、前記ＡＧＧＰＣＲのためのプライマーが、前記ＣＧＧリピートと、前記３’末端に前記「Ａ」ヌクレオチドとの両方を含む前記プライマーである、こと；
前記ＧＳＰＣＲおよび前記ＡＧＧＰＣＲの両方のためのＰＣＲ増幅を行うこと、ならびに
ＰＣＲ後のクリーンアップを行うこと、を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＧＳＰＣＲ増幅が、ＧＣリッチＰＣＲ反応緩衝液およびＧＣリッチ分離能溶液を含むＧＣリッチＰＣＲシステムを使用して行われる、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２０２０年１月３０日に出願された米国仮出願第６２／９６７，７９２号に基づく利益および優先権を主張し、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 3,400 文字）【０００２】
分野
本開示は、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳまたはＦＲＡＸ）臨床試験、特に臨床試験への実装のためのＦＲＡＸＡＧＧ中断ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイおよびＡＧＧ中断の遺伝子型決定アルゴリズムに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ＰＣＲおよび関連する増幅技術を分析用途に使用することができる。ＰＣＲの典型的な分析用途は、多型を有する遺伝子座を含む遺伝子型の状態または決定の診断を含む。医学的に関連する多型を示す遺伝子座の例は、Ｘ染色体上のヒトＦＭＲ１遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）である。正常個体は、典型的には、この遺伝子座に５～４４のＣＧＧリピートを有する。対照的に、大きなＣＧＧリピート伸長（２００超リピート、完全変異対立遺伝子）を含有するこの遺伝子座の対立遺伝子は、ＦＭＲ１遺伝子発現を破壊し、ＦＸＳを引き起こす。さらに、前変異（ＰＭ）対立遺伝子（５０～２００リピート）を有する個体は、遅発性神経変性疾患、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）または脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全（ＦＸＰＯＩ）を発症するリスクがある。女性ＰＭ対立遺伝子キャリア（２０１分の１のｐａｎ－ｅｔｈｉｃ頻度）は、完全変異対立遺伝子を子孫に伝達するリスクがある。このリスクは、脆弱ＸＰＣＲアッセイによって測定されるＣＧＧリピートのサイズ、およびＣＧＧリピート間のＡＧＧ中断の数に依存する（通常、９～１１のＣＧＧリピートごとに起こる）。
【０００４】
５５～９０リピートのＰＭ対立遺伝子が、キャリアの女性によって伝達された場合、子孫における完全変異にまで拡大するリスクは、ＣＧＧリピート配列におけるＡＧＧ中断の数の増加と共に減少する。９０超のリピートを有するＰＭ対立遺伝子の場合、伸長リスクは、ＡＧＧ中断の数にかかわらず５０％超である。したがって、ＡＧＧ中断ＰＣＲアッセイは、５５～９０のＣＧＧリピートを有するＰＭ対立遺伝子についてのＡＧＧ中断の特徴付けにおいて最も大きな臨床的有用性を有し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
様々な実施形態では、試料に対して行われた脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）アッセイから生データを得ることであって、生データが、キャピラリー電気泳動によって分離された遺伝子特異的（ＧＳ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）データおよびＡＧＧ中断ＰＣＲデータを含むことと、生データにおいて同定された第１の対立遺伝子についての予想ＡＧＧピークサイズを決定することと、生データを反復的に探索し、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された探索空間の第１のセットを使用して、第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することと、ＧＳＰＣＲデータおよび第１の対立遺伝子上で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第１の対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数を決定することと、ＧＳＰＣＲデータおよび第１の対立遺伝子上で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第１の対立遺伝子上の最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を決定することと、最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて、第１の対立遺伝子についてのＡＧＧ遺伝子型を生成することと、第１の対立遺伝子についてＡＧＧ遺伝子型を提供することと、を含む、コンピュータ実装方法が提供される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＧＳＰＣＲデータおよび第１の対立遺伝子上で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第１の対立遺伝子上の任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数を決定することをさらに含み、第１の対立遺伝子のＡＧＧ遺伝子型が、最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数、任意の２つの隣接するＡＧＧ中断によって分離されたＣＧＧリピートの数、および最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて生成される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本方法は、生データを反復的に探索し、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて決定された探索空間の第２のセットを使用して、第２の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することと、ＧＳＰＣＲデータおよび第２の対立遺伝子上で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第２の対立遺伝子上の最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数を決定することと、ＧＳＰＣＲデータおよび第２の対立遺伝子上で同定された１またはそれを超えるＡＧＧピークに基づいて、第２の対立遺伝子上の最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数を決定することと、最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数に基づいて、第２の対立遺伝子についてのＡＧＧ遺伝子型を生成することと、第２の対立遺伝子についてのＡＧＧ遺伝子型を提供することと、をさらに含み、（ｉ）第１の対立遺伝子が正常な対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子が前変異対立遺伝子である、（ｉｉ）第１の対立遺伝子が正常な対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子が異なる正常な対立遺伝子である、または（ｉｉｉ）第１の対立遺伝子が前変異対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子が異なる前変異対立遺伝子である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本方法は、試料に関連する対象についてのリスクスコアを、第１の対立遺伝子、第２の対立遺伝子、または第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子の両方について生成されたＡＧＧ遺伝子型に基づいて決定することをさらに含み、リスクスコアが、対象が遅発性神経変性疾患、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）もしくは脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能不全（ＦＸＰＯＩ）を発症するリスク、または完全変異対立遺伝子を対象の子孫に伝達するリスクもしくはそれらの任意の組み合わせを同定する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、生データを反復的に探索し、第１の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することが、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて、第１の対立遺伝子についての探索空間の第１のセットの第１の探索空間を決定することと、生データを探索し、第１の探索空間を使用して第１の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークを同定することと、第１の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークのピークサイズに基づいて、第１の対立遺伝子についての第２の探索空間を決定することと、生データを反復的に探索し、第２の探索空間を用いて第１の対立遺伝子上の１またはそれを超える追加のＡＧＧピークを同定することと、を含み、最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数が、ＧＳＰＣＲデータ、第１の対立遺伝子で同定された初期ピーク、および第１の対立遺伝子で同定された１またはそれを超える追加のピークに基づいて、第１の対立遺伝子について決定される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、生データを反復的に探索し、第２の対立遺伝子上の１またはそれを超えるＡＧＧピークを同定することが、予想ＡＧＧピークサイズに基づいて、第２の対立遺伝子についての探索空間の第２のセットの第１の探索空間を決定することと、生データを探索し、第２の探索空間を使用して第２の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークを同定することと、第２の対立遺伝子上の初期ＡＧＧピークのピークサイズに基づいて、第２の対立遺伝子についての第２の探索空間を決定することと、生データを反復的に探索し、第２の探索空間を使用して第２の対立遺伝子上の１またはそれを超える追加のＡＧＧピークを同定することと、を含み、最後のＡＧＧ中断の下流のＣＧＧリピートの数および最初のＡＧＧ中断に先行するＣＧＧリピートの数が、ＧＳＰＣＲデータ、第２の対立遺伝子で同定された初期ピーク、および第２の対立遺伝子で同定された１またはそれを超える追加のピークに基づいて、第２の対立遺伝子について決定される。
（【００１１】以降は省略されています）

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