発明の詳細な説明【技術分野】 【０００１】 関連出願 本出願は、２００８年８月１４日出願の米国予備特許出願第６１／０８８，８９８号の優先権を主張し、それらの内容は、本明細書中に援用される。 続きを表示（約 3,900 文字）【０００２】 米国連邦政府後援研究または開発 ［不適用］ ［マイクロフィッシュ／著作権引例］ ［不適用］ 本発明は、精製済み間葉系幹細胞組成物および間葉系幹細胞組成物を精製する方法に関する。 【背景技術】 【０００３】 [0001]間葉系幹細胞（単数または複数の「ＭＳＣ」）は、骨髄、血液、真皮、骨膜および他の体組織において見出されうるし、そしていろいろな in vivo または in vitro の 因子および影響に依存して、脂肪組織、疎性結合組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、骨髄支質組織、筋組織、線維性結合組織および心臓組織を含めたいろいろな細胞タイプへと分化することができる。このような細胞は、例えば、米国特許第５，１９７，９８５号；第５，２２６，９１４号；第５，４８６，３５９号；第５，８３７，５３９号および第６，０８７，１１３号に開示されているが、それらは、各々独立して、そのまま援用される。 【０００４】 [0002]ＭＳＣは、組織環境に基づいて、筋肉、骨、軟骨、骨髄支質、腱および脂肪などの系統へ分枝し（engraft）且つ選択的に分化することが分かった。それらの細胞由来お よび表現型ゆえに、これら細胞は、有害な免疫応答を引き起こすことがなく、無関係なヒトドナーに由来する製品の開発を可能にする。 【０００５】 [0003]概して、ＭＳＣは、それらが得られる組織から単離され、精製後、適当な培地中で増える。その培地は、血清タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンなどの血清アルブミン）を含む血清；増殖因子；およびサイトカインのような、ＭＳＣの増量を支持するいろいろな成分を含有する。単離、精製および培養物増量後、それらＭＳＣに、一連の洗浄を、そして場合により、遠心分離を行う。次に、ＭＳＣは、適当な低温保存用基剤、例えば、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）を含む低温保存用基剤中で凍結且つ貯蔵することができる。その後、ＭＳＣを、患者への投与直前に融解させる。 【０００６】 [0004]ＭＳＣの増量のための製造工程は、非自己血清の存在下における細胞培養と、非自己トリプシンによる細胞収集を必要とする；いくつかの方法において、非自己血清は、ウシ胎仔血清（「ＦＢＳ」）であり、そして非自己トリプシンは、ブタトリプシンである。動物試薬を用いたヒトＭＳＣ（「ｈＭＳＣ」）の ex vivo 増量は、最終製品中に残留 する非ヒト由来の巨大分子（例えば、ブタおよびウシ由来の巨大分子）の存在をもたらす。非ヒト生成物を含む基剤中でｈＭＳＣを増量後、ヒト生成物を含む基剤中で増量したｈＭＳＣに相対して、増加量の異種物質が認められることがありうる。 【０００７】 [0005]ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）は、ＦＢＳの有意の成分である。ＢＳＡもブタトリプシンも、既知のアレルゲンである。そのようなものとして、それらは、ウシおよびブタ巨大分子に感受性の患者において有害反応の引き金を引くことがありうるし、しかも多重暴露時に非アレルギー性患者を感作させて、アレルギー性反応をもたらすことがあ りうる（例えば、Colten HR et al., N Engl J Med, 1975, 292:1050; Moneret-Vautrin A. et al., Allergy, 1991, 46:228; Orta M et al., Ann Allergy Asthma Immunol 2003, 90:446; de Benito V. et al., Allergologia et Immunopathologia, 2001, 29:272 を参照されたい）。培養で増量したＭＳＣ中に存在する増加量のＦＢＳも、患者に、望ましくない免疫応答、肺塞栓症、血管収縮、心臓性ショックまたは死亡などの望ましくない副作用を引き起こすかもしれない。残留するＢＳＡまたはブタトリプシンの存在は、免疫原性を増加させ且つレシピエントからのＭＳＣのクリアランスまたは排泄を促進するかもしれない。培養で増量したＭＳＣを含む医薬組成物中に存在する増加量のＦＢＳは、このようなＭＳＣに基づく療法を受けている患者へ、ウイルス、プリオン病および異種タンパク質を伝播するリスクを増加させることがありうる。培養で増量したｈＭＳＣを含む医薬組成物中に存在する増加量のＦＢＳ、具体的には、ＢＳＡは、これら異種物質に対する免疫応答を開始するかもしれない。例えば、患者に投与されたＭＳＣ標品が、ＢＳＡまたは他の異種タンパク質を含有する場合、このような異種タンパク質は、望ましくない免疫応答の引き金を引くかもしれない。異種タンパク質は、細胞性または体液性免疫応答（例えば、抗ウシ血清タンパク質抗体の発生）を引き起こすかもしれないし、それは、特に、このような異種タンパク質が、ＭＳＣ細胞表面膜と結合した状態になるならば、あまり有効でないＭＳＣ分枝を生じるかもしれない。そのようなものとして、新しいアプローチは、培養で増量したＭＳＣを含む医薬組成物中に存在するＦＢＳ、具体的には、ＢＳＡを含めた異種物質の量を減少させる必要がある。新しいアプローチは、培養で増量したＭＳＣ中に存在する糖類、タンパク質および他の巨大分子を含めた異種物質の量を減少させる必要があり、それが、得られたＭＳＣ組成物の安全プロフィールを増加させうると考えられる。 【０００８】 [0006]自己ヒト血清などの代替血清を含む基剤が考えられてきたが、しかしながら、自己血清の使用は、最終ＭＳＣ製品中に必要な細胞の量が、一定量の自己血清中で増殖させることができる量を超える場合は不可能である。更に、自己ヒト血清の使用は、その患者が、ＭＳＣ療法の開始に先んじて血清を供与するのに十分な時間を有し且つ十分に健康であろうということを前提とする。現在慣用的なＭＳＣ培養法は、典型的に、薬学的処置を構成する適当数の細胞を単離し、増量し、収集し、そして精製するのに２～１０週間を必要とする。いくつかの場合、薬学的処置は、１用量から成る。他の場合、薬学的処置は、２またはそれを超える用量から成る。残念ながら、いくつかの場合、ＭＳＣ療法は、臨床症状の診断または症候から約２週間未満、または臨床症状の診断または症候から約１週間未満、または臨床症状の診断または症候から約４８時間未満に要求される。ＭＳＣ療法が、臨床症状の診断または症候から短時間の内に要求される場合、既に製造され、精製され、そして低温保存されていたｈＭＳＣは、急性疾患の診断または症候時に利用可能であるという有意の利点を示す。 【０００９】 [0007]更に、自己ヒト血清を含めたヒト血清は、疾患、例えば、ウイルス性疾患を、ＭＳＣ医薬組成物のレシピエントへ伝播するリスクの統計的に有意の増加を示す。 [0008]Spees et al. は、ウシ胎仔血清（「ＦＣＳ」）および自己ヒト血清中での連続 継代を含む基剤の組合せに言及している。（Spees et al., Mol Therapy, 2004, 9: 747 ）。基剤の連続組合せによって生産された最終組成物は、５０回洗浄サイクル後の標識されたＦＣＳのＳＤＳ－Page 電気泳動によって、試料あたりの残留ＦＣＳに１５倍を超え る範囲を生じた。自己ヒト血清と、より再現性のある最終組成物を与えることがない十分な洗浄とを必要とするプロトコルは、理論的には興味深いが、ヒトへの投与に適する医薬組成物を製造するのに必要な品質または一貫性（consistency）を与えない。 【００１０】 [0009]アレルギー性患者の中での臨床的反応性についてのリスク用量および限界値は、多数の抗原について決定された。（Moneret-Vautrin A. & Kanny G., Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2004, 4:215; Bindslev-Jensen C et al., Allergy, 2002, 57:741）。 これら限界値は、抗原の経口投与については決定されているが、アレルゲンへの静脈内（ 「ＩＶ」）暴露についての限界値は未知である。（Wensing M. et al., J Allergy Clin Immunol, 2002, 110:915; Taylor SL et al., Clin Exp Allergy, 2004, 34:689）。ＭＳＣを含む組成物のＩＶ投与に関する治療的判断は、限界データの不存在と、細胞性および動物に由来する生成物が重篤な有害反応（例えば、アナフィラキシーおよび血清病様疾患）を引き起こすかもしれないということを示している参考文献の報告によって複雑になる。（Moneret-Vautrin A et al., Allergy, 1991, 46:228; Orta M et al., Ann Allergy Asthma Immunol 2003, 90:446; de Benito V. et al., Allergologia et Immunopathologia, 2001, 29:272）。 （【００１１】以降は省略されています） この特許をJ-PlatPat（特許庁公式サイト）で参照する
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