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公開番号2025118621
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-13
出願番号2025062890,2022532237
出願日2025-04-07,2020-07-22
発明の名称細胞からミトコンドリアを得る方法および得られたミトコンドリア
出願人ルカ・サイエンス株式会社
代理人個人
主分類C12N 1/02 20060101AFI20250805BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ミトコンドリアを細胞から得る方法、そのような方法によって得られたミトコンドリア、およびそのような方法によって得られたミトコンドリアの使用方法を提供する。
【解決手段】ミトコンドリアを細胞から単離する方法であって、
(i)第1の溶液中の細胞を界面活性剤に関する臨界ミセル濃度未満の濃度の界面活性剤で処理すること、
(ii)前記細胞内のミトコンドリアと前記界面活性剤との接触を防ぐために前記界面活性剤を除去して界面活性剤を実質的に含まない第2の溶液を形成すること、
(iii)前記第2の溶液中の前記細胞をインキュベートすること、および
(iv)前記第2の溶液中に放出されたミトコンドリアを回収すること、を含む方法を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
単離されたミトコンドリアの集団であって、
（ｉ）前記集団中のミトコンドリアの少なくとも８０％は無傷の内膜および外膜を有し
、
（ｉｉ）前記集団中のミトコンドリアの少なくとも８０％は蛍光指示薬によって測定す
ると分極化しており、
および／または
（ｉｉｉ）前記集団中のミトコンドリアの少なくとも８０％は細胞外環境で機能的能力
を維持する、
単離されたミトコンドリアの集団。
続きを表示（約 820 文字）【請求項２】
（ｉｉｉ）の細胞外環境での前記機能的能力が膜電位の蛍光指示薬によって測定される
、請求項１に記載の単離されたミトコンドリアの集団。
【請求項３】
（ｉｉｉ）の細胞外環境が約８～約１２ｍｇ／ｄＬの全カルシウム濃度を含む、請求項
１に記載の単離されたミトコンドリアの集団。
【請求項４】
（ｉｉｉ）の細胞外環境が約４～約６ｍｇ／ｄＬの遊離／活性カルシウム濃度を含む、
請求項１に記載の単離されたミトコンドリアの集団。
【請求項５】
前記集団中のミトコンドリアの少なくとも８０％がダイナミン関連タンパク質１（ｄｒ
ｐ１）依存性分裂を起こしていない、請求項１に記載の単離されたミトコンドリアの集団
。
【請求項６】
前記ミトコンドリアの内膜が、高密度に折りたたまれたクリステを含む、請求項１に記
載の単離されたミトコンドリアの集団。
【請求項７】
前記集団中のミトコンドリアの少なくとも８０％が非糸状の形状を有する、請求項１～
６のいずれか一項に記載の単離されたミトコンドリアの集団。
【請求項８】
前記ミトコンドリアの少なくとも８５％が非糸状の形状を有する、請求項７に記載の単
離されたミトコンドリアの集団。
【請求項９】
前記ミトコンドリアの少なくとも９０％が非糸状の形状を有する、請求項８に記載の単
離されたミトコンドリアの集団。
【請求項１０】
前記ミトコンドリアが、グルコース調節タンパク質７５（ＧＲＰ７５）の発現によって
測定すると、ミトコンドリア会合膜（ＭＡＭ）との会合の減少を示す、請求項１～９のい
ずれか一項に記載の単離されたミトコンドリアの集団。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は２０１９年７月２４日に出願の日本国出願番号第２０１９－１３６２８３号へ
の優先権を主張し、その全内容はここに参照により組み込まれる。
続きを表示（約 5,200 文字）【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、下の３つの重要な役割を演ずるタイプのオルガネラである：１）Ａ
ＴＰ合成等の代謝、２）Ｃａ２＋および反応性酸素種等の細胞内シグナル伝達、ならびに
３）アポトーシスおよび壊死等の細胞死の制御。この意味で、ミトコンドリアは疾患に強
くかかわり、健康の観点から多くの研究者によって研究されてきた。
【０００３】
ミトコンドリアの機能のために、折りたたまれた内膜および周囲の外膜、および内膜に
位置する電子伝達系が重要な役割を演ずる。内膜はクリステと呼ばれる高度に折りたたま
れた構造を形成し、それは、クリステ膜の中に電子伝達系のスーパーコンプレックスを保
持し、クリステ空間の中にポンプ輸送されたプロトンを閉じ込めることによってプロトン
濃度を高くしておくと考えられている。電子伝達系によって形成される電気化学的プロト
ン勾配は、アニオンの輸送に加えてＡＴＰ合成およびカチオン輸送を可能にする。
【０００４】
低下したミトコンドリア機能は、様々な疾患を引き起こし得る。ミトコンドリア機能お
よび構造的完全性を保持する方法で細胞からミトコンドリアを単離するために、当技術分
野で公知の方法は現在ない。この開示は、このおよび他の必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、単離されたか得られたか処理されたミトコンドリアの集団を提供し、ここで
集団中のミトコンドリアは優れた機能的能力を示す。例えば、一態様では、本開示は単離
されたミトコンドリアの集団であって、集団中のミトコンドリアのうち少なくとも約６０
％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０
％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％は無傷の内膜お
よび外膜を有し；および／または集団中のミトコンドリアのうち少なくとも約６０％、少
なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少
なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％は、蛍光指示薬によっ
て測定すると分極化している、単離されたミトコンドリアの集団を提供する。ある実施態
様では、蛍光指示薬は正荷電色素、例えばＪＣ－１、テトラメチルローダミンメチルエス
テル（ＴＭＲＭ）およびテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）からなる群
から選択される。
【０００６】
ある実施態様では、本開示は、集団中のミトコンドリアのうち少なくとも約６０％、少
なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少
なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％は、細胞外環境で機能
的能力を維持する（例えば、分極化している）、単離されたミトコンドリアの集団を提供
する。ある実施態様では、細胞外環境での機能的能力は、膜電位の蛍光指示薬によって測
定される。ある実施態様では、蛍光指示薬は正荷電色素、例えばＪＣ－１、ＴＭＲＭおよ
びＴＭＲＥからなる群から選択される。ある実施態様では、細胞外環境は約４ｍｇ／ｄＬ
～約１２ｍｇ／ｄＬまたは約１ｍｍｏｌ／Ｌ（１０００μＭ）～約３ｍｍｏｌ／Ｌ（３０
００μＭ）の全カルシウム濃度を含むことができる。例えば、ある実施態様では、細胞外
環境は約８ｍｇ／ｄＬ～約１２ｍｇ／ｄＬまたは約２ｍｍｏｌ／Ｌ（２０００μＭ）～約
３ｍｍｏｌ／Ｌ（３０００μＭ）の全カルシウム濃度を含む。ある実施態様では、細胞外
環境は約４ｍｇ／ｄＬ～約６ｍｇ／ｄＬまたは約１ｍｍｏｌ／Ｌ（１０００μＭ）～約１
．５ｍｍｏｌ／Ｌ（１５００μＭ）の遊離または活性カルシウムの濃度を含む。ある実施
態様では、ミトコンドリアの集団は、細胞中のカルシウム環境と比較してより高いカルシ
ウム濃度を有する環境の中で機能的能力を維持する。
【０００７】
ある実施態様では、集団中のミトコンドリアのうち少なくとも約６０％、少なくとも約
６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約
８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％は、ダイナミン関連タンパク質１
（ｄｒｐ１）依存性分裂を起こしていない、単離されたミトコンドリアの集団がある実施
態様において提供される。ある実施態様では、内膜および外膜を有する単離されたミトコ
ンドリアの集団であって、ミトコンドリアの内膜は高密度に折りたたまれたクリステを含
む、単離されたミトコンドリアの集団がある実施態様において提供される。
【０００８】
ある実施態様では、集団中のミトコンドリアのうち少なくとも約６０％、少なくとも約
６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約
８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％は、実質的に非糸状の、非分枝状
の構造または形状を有する、単離されたミトコンドリアの集団がある実施態様において提
供される。例えば、ある実施態様では、ここで提供されるミトコンドリアは、顕微鏡下で
見たとき円形、点状、球状、不規則形および／またはわずかに伸長した形、またはその任
意の混合の外観である。ある実施態様では、集団におけるミトコンドリアのうち少なくと
も約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくと
も約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、４
：１以下、３．５：１以下または３：１以下の長径対短径比を有する。ある実施態様では
、ここで提供されるミトコンドリアの集団中の単離されたミトコンドリアのうち、少なく
とも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なく
とも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％は、
ミトコンドリアの流体力学的直径の２倍または３倍より短い長さを有する。このように、
ここで提供される単離されたミトコンドリアは、細胞の中にあるほとんどのミトコンドリ
アの形状（糸状）と比較した場合、著しく異なる形状（非糸状）を有する。したがって、
ある実施態様では、ここで提供されるミトコンドリアの集団は、集団中のミトコンドリア
のうち少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７
５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも
約９５％は形状が非糸状であるという点で、細胞中に存在して単離されていないミトコン
ドリアと異なる形状を有する。ある実施態様では、ここで提供される単離されたミトコン
ドリアの集団は、ミトコンドリア会合膜（ＭＡＭ；ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ－ａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｄｍｅｍｂｒａｎｅ）との会合の減少を示す。ある実施態様では、ＭＡＭと
の会合は、グルコース調節タンパク質７５（ＧＲＰ７５）の発現によって測定される。あ
る実施態様では、ここで提供される単離されたミトコンドリアの集団は、細胞中のミトコ
ンドリアと、ならびに／またはある実施態様においてさらに記載される通り従来の単離方
法、例えば、ホモジナイゼーションおよび／もしくは高レベルの界面活性剤法を含む方法
によって得られたミトコンドリアと比較した場合、約６０％、少なくとも約６５％、少な
くとも約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％またはそれ以下のＭＡＭとの
会合を示す。ある実施態様では、ここで提供される単離されたミトコンドリアの集団は、
ＭＡＭとの会合の減少を示し、減少は、細胞中のミトコンドリア、または従来の単離方法
によって単離されたミトコンドリアの、ＭＡＭとの会合と比較して、少なくとも約３０％
、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％
またはそれ以上である。
【０００９】
ある実施態様では、ここで提供される単離されたミトコンドリアの集団は、サイズが約
５００ｎｍ～約３５００ｎｍである。ある実施態様では、集団中のミトコンドリアのうち
少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、
少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％ま
たは少なくとも約９９％は、サイズが約５００ｎｍ～約３５００ｎｍである。ある実施態
様では、集団中のミトコンドリアの平均サイズは、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７０
０ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、約１０００ｎｍ、約１１００ｎｍ、約１２００ｎ
ｍ、約１３００ｎｍ、約１４００ｎｍ、約１５００ｎｍ、約１６００ｎｍ、約１７００ｎ
ｍ、約１８００ｎｍ、約１９００ｎｍ、約２０００ｎｍ、約２１００ｎｍ、約２２００ｎ
ｍ、約２３００ｎｍ、約２４００ｎｍ、約２５００ｎｍ、約２６００ｎｍ、約２７００ｎ
ｍ、約２８００ｎｍ、約２９００ｎｍ、約３０００ｎｍ、約３１００ｎｍ、約３２００ｎ
ｍ、約３３００ｎｍ、約３４００ｎｍまたは約３５００ｎｍである。ある実施態様では、
単離されたミトコンドリアの集団の多分散指数（ＰＤＩ）は約０．２～約０．８である。
ある実施態様では、単離されたミトコンドリアの集団のＰＤＩは約０．２～約０．５であ
る。ある実施態様では、単離されたミトコンドリアの集団のＰＤＩは約０．２５～約０．
３５である。ある実施態様では、ミトコンドリアの集団のゼータ電位は約－１５ｍＶ～約
－４０ｍＶである。ある実施態様では、ミトコンドリアの集団のゼータ電位は約－２０ｍ
Ｖ、約－２５ｍＶ、約－３０ｍＶ、約－３５ｍＶまたは約－４０ｍＶである。
【００１０】
ある実施態様では、ここで提供される単離されたミトコンドリアの集団は、単離された
ミトコンドリアの集団が細胞の集団と接触すると、細胞への組込み、および／または細胞
中の内在性ミトコンドリアとの共局在が可能である。例えば、ある実施態様では、本開示
は、細胞からミトコンドリアを得、その後細胞（例えば、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖ
ｉｖｏの細胞）の集団を単離したミトコンドリアの集団と接触させる方法を提供する。そ
のようなある実施態様では、ここで記載されるｉＭＩＴ法を通して単離される、ここで提
供されるミトコンドリアは、細胞に存在する内在性ミトコンドリアと共局在することが可
能である。ある実施態様では、ここで提供されるミトコンドリアは、それらが接触した細
胞に存在するミトコンドリアと融合することがさらに可能である。ある実施態様では、単
離されたミトコンドリアの集団のかなりの割合は、細胞中の内在性ミトコンドリアとの共
局在および／または融合が可能である。例えば、ある実施態様では、集団中のミトコンド
リアのうち少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも
約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なく
とも約９５％は、細胞中の内在性ミトコンドリアとの共局在および／または融合が可能で
ある。したがって、ここで提供されるミトコンドリアは、それらが細胞中の内在性ミトコ
ンドリアとの共局在および／または融合が可能であるという点で、従来の方法を通して単
離されるミトコンドリアと著しく異なる。
（【００１１】以降は省略されています）

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