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公開番号2025114741
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-08-05
出願番号2025078375,2023176817
出願日2025-05-09,2020-08-18
発明の名称抗VEGFタンパク質組成物及びその製造方法
出願人リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド,REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12P 21/02 20060101AFI20250729BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】アフリベルセプトバリアントの量が減少しているアフリベルセプトを産生する方法を提供する。
【解決手段】合成培地(CDM)中で培養された宿主細胞において発現されるアフリベルセプトバリアントの量が減少しているアフリベルセプトを産生する方法であって、前記CDM中の鉄の累積濃度が約55.0μM以下である、前記CDM中の銅の累積濃度が約0.8μM以下である、前記CDM中のニッケルの累積濃度が約0.4μM以下である、前記CDM中の亜鉛の累積濃度が約56.0μM以下である、前記CDM中のシステインの累積濃度が約10.0mM以下である、並びに/又はバリアントの目標値が、任意の単一の抗酸化剤については約0.001mM～約10mM、複数の抗酸化剤が加えられる場合には総抗酸化剤が約30mM以下の、前記CDM中の抗酸化剤の累積濃度を加えることで得られる、方法である。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
合成培地（ＣＤＭ）中で培養された宿主細胞において発現されるアフリベルセプトバリアントの量が減少しているアフリベルセプトを産生する方法であって、
（ａ）アフリベルセプトを発現するように遺伝子改変された前記宿主細胞を提供する工程と、
（ｂ）アフリベルセプト試料を産生するために、前記宿主細胞がアフリベルセプトを発現する好適な条件の下で、前記ＣＤＭ中で前記宿主細胞を培養する工程と、
（ｃ）前記宿主細胞により産生されるタンパク質を回収する工程であって、アフリベルセプトバリアントの目標値が以下である：
ｉ．バリアントの前記目標値が、前記ＣＤＭを使用することにより得られ、前記ＣＤＭ中の鉄の累積濃度が約５５．０μＭ以下である、
ｉｉ．バリアントの前記目標値が、前記ＣＤＭを使用することにより得られ、前記ＣＤＭ中の銅の累積濃度が約０．８μＭ以下である、
ｉｉｉ．バリアントの前記目標値が、前記ＣＤＭを使用することにより得られ、前記ＣＤＭ中のニッケルの累積濃度が約０．４μＭ以下である、
ｉｖ．バリアントの前記目標値が、前記ＣＤＭを使用することにより得られ、前記ＣＤＭ中の亜鉛の累積濃度が約５６．０μＭ以下である、
ｖ．バリアントの前記目標値が、前記ＣＤＭを使用することにより得られ、前記ＣＤＭ中のシステインの累積濃度が約１０．０ｍＭ以下である、並びに／又は
ｖｉ．バリアントの前記目標値が、任意の単一の抗酸化剤については約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭ、複数の抗酸化剤が加えられる場合には総抗酸化剤が約３０ｍＭ以下の、前記ＣＤＭ中の抗酸化剤の累積濃度を加えることで得られる、回収する工程と
を含む、方法。
続きを表示（約 650 文字）【請求項２】
バリアントの前記目標値が、約２０％未満のアフリベルセプトバリアントを含むタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＤＭ中の鉄の前記累積濃度が約５５．０μＭ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＤＭ中の銅の前記累積濃度が約０．８μＭ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＤＭ中のニッケルの前記累積濃度が約０．４μＭ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＤＭ中の亜鉛の前記累積濃度が約５６．０μＭ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＤＭ中のシステインの前記累積濃度が約１０．０ｍＭ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＤＭ中の抗酸化剤の前記累積濃度が、任意の単一の抗酸化剤については約０．００１ｍＭ～約１０ｍＭ、複数の抗酸化剤が加えられる場合には総抗酸化剤が約３０ｍＭ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が、ＣＨＯ、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、胎児腎細胞、及びＢＨＫからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記清澄化された回収物が１種以上のアフリベルセプトバリアントを含み、前記バリアントが少なくとも１つの酸化アミノ酸残基を有する、請求項１に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。当該ＡＳＣＩＩコピーは２０２０年８月１３日に作成され、０７０８１６－０２２５１＿ＳＬ．ｔｘｔと明記され、サイズは１３４，３８５バイトである。
続きを表示（約 1,700 文字）【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月１３日に出願された米国仮特許出願番号第６３／０６５，０１２号に対する優先権及びその恩典を主張するものであり、その内容は全体が本明細書に参照として組み入れられる。
【０００３】
分野
本発明は概して、抗ＶＥＧＦ組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
タンパク質をベースとするバイオ医薬組成物は、眼科疾患、がん、自己免疫疾患、感染症、並びに他の疾患及び障害の治療薬である、研究目的の重要な製品として台頭してきた。バイオ医薬品は、製薬産業の急速に成長している製品区分の１つである。
【０００５】
血管内皮細胞に対し選択性を有する細胞由来の二量体マイトジェンのクラスは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と同定され、かつこの名称で呼ばれている。
【０００６】
持続的な血管新生は、乾癬、関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、糖尿病性網膜症、及び血管新生緑内障などの特定疾患を引き起こしたり、悪化させたりする可能性がある。ＶＥＧＦ活性の阻害薬は、こうした疾患、並びに他のＶＥＧＦ誘発性病理学的血管新生及び血管透過性状態、例えば腫瘍血管形成の治療薬として有用である。アンジオポエチン及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーは、血管内皮細胞に対して主に特異性があると考えられている唯一の成長因子である。
【０００７】
いくつかの眼障害は、病理学的血管新生に関連する。例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の発症は、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）と呼ばれるプロセスに関連する。ＣＮＶからの漏出により、黄斑浮腫、及び視力喪失の原因となる黄斑下の分泌液の集合を引き起こす。糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、血管新生成分を有する別の眼障害である。ＤＭＥは糖尿病患者における中程度の視力喪失の最も広く認められている原因であり、網膜の血管に悪影響を与える疾患である糖尿病性網膜症の一般的な合併症である。臨床的に重要なＤＭＥは、鮮明な直視に関係している網膜の感光部分である黄斑の中心へ分泌液が漏出する時に発生する。黄斑中に分泌液が存在することで、重症の視力喪失又は失明を引き起こす可能性がある。
【０００８】
例えばＶＥＧＦトラップのＥｙｌｅａ（アフリベルセプト）といった様々なＶＥＧＦ阻害薬は、こうした眼障害を処置するために承認されている。
【発明の概要】
【０００９】
概要
本発明は、融合タンパク質である、ＶＥＧＦトラップタンパク質であるアフリベルセプトを含む、抗ＶＥＧＦタンパク質に関する。本発明はまた、新規の抗ＶＥＧＦタンパク質、アフリベルセプトＭｉｎｉＴｒａｐ又はＶＥＧＦＭｉｎｉＴｒａｐ（特に明記しない限り、ＭｉｎｉＴｒａｐと総称される）に関する。本明細書では、関心対象のタンパク質を産生する効率的かつ効果的な手段を提供する製造様式を含む、これらの抗ＶＥＧＦタンパク質を作製する方法を開示する。一態様においては、本発明は抗ＶＥＧＦタンパク質を産生する合成培地（ＣＤＭ）の使用を目的に行われる。特定の態様においては、関心対象のＣＤＭは使用時、タンパク質試料を産生するＣＤＭであり、この試料は黄褐色であり、酸化種を含み得る。更に本出願では、アフリベルセプト及びＶＥＧＦＭｉｎｉＴｒａｐのタンパク質バリアントは、付随する製造方法と共に開示される。
【００１０】
アフリベルセプトの製造
本開示は、細胞培地を使用するアフリベルセプトの製造を説明する。一実施形態において、細胞培養培地は合成培地（「ＣＤＭ」）である。ＣＤＭは、これがタンパク質を含まず動物由来成分を使用しない合成製剤であり、培地の組成物に関して確実性が存在することから、多くの場合使用される。別の実施形態において、細胞培養培地はダイズ加水分解培地である。
（【００１１】以降は省略されています）

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