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公開番号2025105691
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-10
出願番号2025068806,2021511656
出願日2025-04-18,2019-09-02
発明の名称血液中または濃縮PBMC中のリンパ球を遺伝子改変するための方法および組成物
出願人エクスマバイオテックコーポレイション
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/86 20060101AFI20250703BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】リンパ球、例えばT細胞および/またはNK細胞を、以前よりも短い時間で、および/または全血もしくはその成分において遺伝子改変するための方法および組成物の提供。
【解決手段】本開示は、リンパ球、例えばT細胞および/またはNK細胞を、以前よりも短い時間で、および/または全血もしくはその成分において遺伝子改変するための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇フィルタアセンブリが反応混合物を形成する前または後に使用され、リンパ球が閉鎖システムにおいて組み換えレトロウイルス粒子と接触されてリンパ球が遺伝子改変される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
Ｔ細胞を遺伝子改変する方法であって、
エクスビボで、対象から採取されたＴ細胞を含む全血を反応混合物中で複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と接触させる工程
を含む方法であって、
ここで、前記反応混合物は、少なくとも５０％の全血を含み、
ここで前記反応混合物は抗凝固剤を含み、そして
ここで前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、以下：
（ａ）それらの表面上にＴ細胞活性化要素；と
（ｂ）１つまたは複数の転写単位を含むポリヌクレオチドであって、ここで前記１つまたは複数の転写単位のそれぞれがＴ細胞で活性なプロモーターに作動可能に連結され、ここで前記１つまたは複数の転写単位が第１のポリペプチドおよび／または阻害性ＲＮＡ分子をコードする、ポリヌクレオチドとを含み、
ここで、前記第１のポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、および／またはリンパ増殖性要素を含む、
方法。
続きを表示（約 820 文字）【請求項２】
エクスビボで細胞を拡張（expanding）する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法であって、前記細胞は、エクスビボで１つの細胞あたり４個以下の細胞分裂で拡張される、方法。
【請求項３】
前記方法は、事前にエクスビボでの刺激を必要としない、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記反応混合物が全血を少なくとも９０％含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記接触させる工程後、前記反応混合物中の前記Ｔ細胞の少なくとも５％が遺伝子改変Ｔ細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞が複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と組み合わされて前記反応混合物を形成する場合、前記Ｔ細胞の少なくとも２５％が休止Ｔ細胞であり、前記接触させる工程が２４時間以下で実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｔ細胞活性化要素が、ＧＰＩアンカーを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔ細胞活性化要素がウイルスエンベロープタンパク質との融合タンパク質である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｔ細胞活性化要素が、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４-１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、またはＣＤ８２に結合することができる１つまたは複数のポリペプチドを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞活性化要素が、ＣＤ３に結合できる１つまたは複数のポリペプチドを含み、前記ＣＤ３に結合できる１つまたは複数のポリペプチドの少なくとも１つが抗体である、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月１７日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５１３９２の一部継続出願であり；２０１８年９月２日に出願された米国仮特許出願第６２／７２６，２９３号；２０１８年９月２日に出願された米国仮特許出願第６２／７２６，２９４号；２０１８年９月６日に出願された米国仮特許出願第６２／７２８，０５６号；２０１８年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／７３２，５２８号；２０１９年３月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／８２１，４３４号；および２０１９年９月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８９４，８５３号の利益を主張し；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５１３９２は、２０１８年３月３日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２０８１８の一部継続出願であり；２０１７年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／５６０，１７６号；２０１７年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／５６４，２５３号；２０１７年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／５６４，９９１号；および２０１８年９月６日に出願された米国仮特許出願第６２／７２８，０５６号の利益を主張し；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２０８１８は、２０１７年３月１９日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２３１１２の一部継続出願；２０１７年７月８日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４１２７７の一部継続出願；２０１７年３月１９日に出願された米国特許出願第１５／４６２，８５５の一部継続出願；２０１７年７月８日に出願された米国特許出願第１５／６４４，７７８号の一部継続出願であり；２０１７年３月３日に提出された米国仮特許出願第６２／４６７，０３９号；２０１７年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／５６０，１７６号；２０１７年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／５６４，２５３号；および２０１７年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／５６４，９９１号の利益を主張し；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２３１１２は、２０１６年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３９０，０９３号；２０１６年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３６０，０４１号；および２０１７年３月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４６７，０３９号の利益を主張し；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４１２７７は、２０１７年３月１９日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２３１１２；２０１７年３月１９日に出願された米国特許出願第１５／４６２，８５５号；２０１６年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３６０，０４１号；および２０１７年３月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４６７，０３９号の利益を主張し；米国特許出願第１５／４６２，８５５号は、２０１６年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３９０，０９３号；２０１６年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３６０，０４１号；および２０１７年３月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４６７，０３９号の利益を主張し；米国特許出願第１５／６４４，７７８号は、２０１７年３月１９日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２３１１２の一部継続出願であり；２０１７年３月１９日に出願された米国特許出願第１５／４６２，８５５号の一部継続出願であり；２０１６年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３６０，０４１号および２０１７年３月３日に提出された米国仮特許出願第６２／４６７，０３９号の利益を主張する。これらの出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 3,000 文字）【０００２】
配列表
本出願は、本出願と同時に提出される電子配列表の資料を参照により本明細書に組み込む。電子配列表の資料は、２０１９年９月２日に作成された「Ｆ１＿００１＿ＷＯ＿０５＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ＿０２＿２０１９．ｔｘｔ」という表題のテキスト（．ｔｘｔ）ファイルとして提出され、ファイルサイズは４５０ＫＢであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、免疫学の分野、またはより具体的には、Ｔリンパ球もしくは他の免疫細胞の遺伝子改変、およびそのような細胞の増殖を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
対象（例えば、患者）から単離されたリンパ球は、インビトロで活性化され、遺伝子改変されて、組み込まれた遺伝子プログラムに基づいて他の細胞および環境とのリダイレクトされた関与を可能にする合成タンパク質を発現することができる。そのような合成タンパク質の例としては、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）が挙げられる。現在使用されている１つのＣＡＲは、細胞外認識ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、および複製能力のない組み換えレトロウイルスによってコードされる１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインの融合である。
【０００５】
組み換えレトロウイルスは非分裂細胞に感染する上で効力を示しているが、休止状態のＣＤ４およびＣＤ８リンパ球はこれらのベクターによる遺伝子導入に抵抗性がある。この困難を克服するために、これらの細胞は、典型的には、ＣＡＲ遺伝子ベクターによる遺伝子改変が起こり得る前に、刺激試薬を使用してインビトロで活性化される。刺激および形質導入に続いて、遺伝子改変された細胞はインビトロで拡張され、その後リンパ球枯渇患者に再導入される。インビボでの抗原の関与により、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達部分は、免疫細胞における活性化関連応答および細胞溶解性分子の放出を開始して、標的細胞死を誘導することができる。
【０００６】
そのような現在の方法は、患者への再注入の前に体外で増殖するＴ細胞の広範な操作および製造、ならびにサイトカインを遊離し、競合する受容体を枯渇させてＴ細胞の生着を促進するリンパ球枯渇化学療法を必要とする。そのようなＣＡＲ療法は、体内に導入された後のインビボでの増殖速度を制御することも、腫瘍の外側にも発現する標的に安全に誘導することもできない。結果として、ＣＡＲ療法は今日、典型的には、１×１０
５
～１×１０
８
細胞／ｋｇでの用量を用いて１２～２８日間エクスビボで拡張された細胞から注入され、標的、例えば腫瘍標的に誘導され、その腫瘍外標的毒性（ｏｆｆｔｕｍｏｒｏｎｔａｒｇｅｔｔｏｘｉｃｉｔｙ）は一般的に許容される。これらの比較的長いエクスビボ拡張時間は、スケーラビリティの課題に加えて、細胞生存率および無菌性、ならびに試料の同一性の問題を引き起こす。したがって、より安全でより効果的なスケーラブルなＴ細胞またはＮＫ細胞治療が強く求められている。
【０００７】
リンパ球の形質導入、増殖および生存を促進するプロセスの理解は、免疫学的プロセスを含む様々な潜在的商業的用途の中心であるため、リンパ球を研究するための改善された方法および組成物が必要である。例えば、リンパ球が遺伝子改変され得る様式、ならびにリンパ球の生存および増殖に影響を与える要因をより良く特徴付けて理解するために使用され得る方法および組成を特定することが有用である。さらに、リンパ球の増殖および生存を促進する組成物を特定することが有用である。そのような組成物は、そのようなプロセスの調節を研究するために使用することができる。リンパ球を研究するための方法および組成物に加えて、改良されたウイルスパッケージング細胞株ならびにそれらを作製および使用する方法が必要である。例えば、そのような細胞株および方法は、組み換えレトロウイルス粒子等の組み換えウイルスの異なる成分を分析する上で、および組み換えレトロウイルス粒子の産生のためにパッケージング細胞株を使用する方法に有用である。
【０００８】
事前活性化およびエクスビボ拡張なしで実行され得るより最近の方法が開発されている。しかしながら、特にそのような方法が例えば注入センター内で対象の血液を採取させ、次いでその同じ日に対象に再導入させる合、そのような方法に必要な複雑さおよび時間をさらに減らすことが非常に望ましいであろう。さらに、より単純で迅速な方法単独、またはより少ない専門機器を必要とする方法は、現在高度に専門化された医療センターでのみ定期的に行われているこれらの細胞治療プロセスを一般化する可能性がある。
【０００９】
一部のグループは、インビボで細胞を形質導入するために、ウイルス粒子を静脈内注入することにより、エクスビボ形質導入の拡張を排除することによって細胞療法のエクスビボ処理を簡素化しようと試みた。しかしながら、そのような方法は大量のベクターを必要とし、またその方法は、凝固因子、および／またはインビボで存在する他の酵素によるレトロウイルス粒子の不活化のリスクを有する。最後に、そのような方法は、非標的細胞／臓器の高レベルの形質導入の危険がある。
【発明の概要】
【００１０】
本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞等のリンパ球を形質導入および／または遺伝子改変するための方法の有効性および安全性に関連する問題を克服するのに役立つ方法、組成物、およびキットである。そのような方法の特定の実施形態は、これらの細胞を用いて養子細胞療法を実施するために有用である。したがって、いくつかの態様では、リンパ球、特にＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための、および／または形質導入および／もしくは遺伝子改変されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞の活性を調節するための方法、組成物、およびキットが本明細書で提供される。そのような方法、組成物、およびキットは、特に組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）、および例示的な実施形態では微小環境が制限された生物学的（「ＭＲＢ」）ＣＡＲｓを発現するＴ細胞および／またはＮＫ細胞に関して、現在の技術よりも改善された効力および安全性を提供する。本明細書で提供される方法によって産生および／または使用される形質導入および／または遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、レトロウイルス（例えばレンチウイルス）粒子を介してレトロウイルス（例えばレンチウイルス）ゲノムから送達される例示的な実施形態では、機能性および機能性の組み合わせを含み、これはそのような細胞およびそのような細胞を利用する方法、例えば研究方法、商業生産方法、および養子細胞療法等に改善された機能を提供する。例えば、そのような細胞は、エクスビボでより短い時間で生成され得、より良く調節することができる改善された増殖特性を有する。
（【００１１】以降は省略されています）

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