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公開番号2025102893
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-08
出願番号2025060230,2023521506
出願日2025-04-01,2021-10-07
発明の名称融合前安定化HMPV Fタンパク質
出願人ボードオブリージェンツ,ザユニバーシティオブテキサスシステム,BOARD OF REGENTS,THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/40 20060101AFI20250701BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】強化された立体構造安定性及び/または抗原性を示す操作されたヒトメタニューモウイルス(hMPV)Fタンパク質を提供する。
【解決手段】複数の特定のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有する、メタニューモウイルス(MPV)Fタンパク質外部ドメインを含む操作されたタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子であって、操作されたタンパク質が、前記複数の特定の配列のうちいずれか1つの配列に対して、T127C及びN153C、ならびに/または、L110C及びN322Cに対応するシステイン置換の対を含む操作されたジスルフィド結合を含み、核酸分子がmRNA分子である、核酸分子が提供される。前記核酸分子を含む医薬組成物も提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号４～７のうちいずれか１つのアミノ酸１９～４８９に対して少なくとも９０％の同一性を有する、メタニューモウイルス（ＭＰＶ）Ｆタンパク質外部ドメインを含む操作されたタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子であって、前記操作されたタンパク質が、配列番号４～７のうちいずれか１つの配列に対して、Ｔ１２７Ｃ及びＮ１５３Ｃ、ならびに／または、Ｌ１１０Ｃ及びＮ３２２Ｃに対応するシステイン置換の対を含む操作されたジスルフィド結合を含み、核酸分子がｍＲＮＡ分子である、前記核酸分子。
続きを表示（約 860 文字）【請求項２】
操作されたタンパク質が、Ｌ２１９及び／またはＶ２３１に対応する位置に置換をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
操作されたタンパク質が、Ｌ２１９Ｋ及びＶ２３１Ｉに対応する置換をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
操作されたタンパク質が、Ｔ３６５Ｃ及びＶ４６３Ｃに対応するシステイン置換の対をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
操作されたタンパク質が、Ｔ１２７Ｃ及びＮ１５３Ｃに対応するシステイン置換の対、Ｔ３６５Ｃ及びＶ４６３Ｃに対応するシステイン置換の対、並びにＬ２１９Ｋに対応する置換を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
操作されたタンパク質が、Ｔ１２７Ｃ及びＮ１５３Ｃに対応するシステイン置換の対、Ｔ３６５Ｃ及びＶ４６３Ｃに対応するシステイン置換の対、並びにＶ２３１Ｉに対応する置換を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
操作されたタンパク質が、Ａ／Ｄ１８５Ｐに対応するプロリン置換をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
操作されたタンパク質が、配列番号４～７のうちいずれか１つの位置８７～１０４に対応する残基からＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲ（配列番号８）への置換をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項９】
操作されたタンパク質が、Ｌ６６、Ｌ７３、Ｎ１４５、Ｑ１９５、Ｅ４５３、Ｋ１８８、Ｈ３６８、Ｄ４６１、Ｔ４９、及び／またはＶ２６２に対応する位置に静電相互作用置換をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１０】
静電相互作用置換が、Ｌ６６Ｎ、Ｌ７３Ｅ、Ｎ１４５Ｅ、Ｑ１９５Ｋ、Ｅ４５３Ｑ、Ｌ６６Ｄ、Ｋ１８８Ｒ、Ｈ３６８Ｒ、Ｄ４６１Ｅ、Ｔ４９Ｅ、及び／またはＶ２６２Ｄに対応する置換を含む、請求項９に記載の核酸分子。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、２０２０年１０月９日に出願された米国仮出願第６３／０８９，９７８号の優先権の利益を主張するものであり、同文献の内容全体が参照により本明細書に援用される。
続きを表示（約 4,900 文字）【０００２】
配列表の参照
本願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、ここに、参照によりその全体が本明細書に援用される。２０２１年１０月７日に作成された該ＡＳＣＩＩの写しは、ＵＴＦＢＰ１２５０ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、５０．６バイトのサイズである。
【０００３】
１．技術分野
本開示は、全般的に、医学、ウイルス学、免疫学、及びタンパク質工学の分野に関する。より具体的には、本開示は、操作されたヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）Ｆタンパク質、ならびに薬物設計及びワクチン製剤化におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連技術の説明
ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）は、２００１年のその発見より前に少なくとも半世紀にわたってヒトにおいて伝播してきた、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ（ニューモウイルス）科の呼吸器ウイルスである（ｖａｎｄｅｎＨｏｏｇｅｎｅｔａｌ．，２００１）。感染はほぼ偏在的に５歳までに起こり、再感染の負荷が生涯を通じて継続する（ｖａｎｄｅｎＨｏｏｇｅｎｅｔａｌ．，２００１）。しかしながら、乳児（６～１２ヶ月）、高齢者、及び免疫不全の人たちは、肺炎及び気管支炎等のより重度の疾患により入院のリスクが増加する（Ｄｅｆｆｒａｓｎｅｓｅｔａｌ．，２００７）。ｈＭＰＶが提示する疾病負荷にもかかわらず、予防または治療のために承認されたワクチンまたは治療薬は存在しない。Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ科の成員として（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（パラミクソウイルス）内の亜科から最近格上げされた）、ｈＭＰＶは、エンベロープを持つマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。この科内のウイルスは、表面に発現した３つの膜タンパク質をコードする。ｈＭＰＶの場合、これらは、小疎水性（ｓｍａｌｌｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）（ＳＨ）、付着（Ｇ）、及び融合（Ｆ）タンパク質である（Ｓｈａｆａｇａｔｉ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，２０１８）。
【０００５】
クラスＩウイルス融合糖タンパク質として、ｈＭＰＶＦは、最初に単一ポリペプチド前駆体（Ｆ
０
）として翻訳される。タンパク質分解切断により、Ｆ
０
は、ジスルフィド結合したＦ
２
及びＦ
１
サブユニットに変換される（図１Ａ）。次いで、３つのＦ
２
／Ｆ
１
ヘテロ二量体が会合して、活性型のタンパク質を構成する準安定な融合前（ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ）三量体となる。細胞培養物中では、このタンパク質分解活性化は、一塩基切断部位でタンパク質を切断するトリプシンの添加によって遂行され得る（ｖａｎｄｅｎＨｏｏｇｅｎｅｔａｌ．，２００１、Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓｅｔａｌ．，２００６、Ｓｃｈｉｃｋｌｉｅｔａｌ．，２００５）。自然感染中に、ｈＭＰＶＦ
０
は、ＴＭＰＲＳＳ２等のトリプシン様細胞外セリンプロテアーゼによって切断されるが、標的細胞と対比して産生細胞内でこれが起こる程度は、明確にされていない（Ｓｈｉｒｏｇａｎｅｅｔａｌ．，２００８）。成熟Ｆ
１
サブユニットのＮ末端は、融合前Ｆ三量体の内部空洞内に位置する、融合ペプチドと呼ばれる疎水性配列を含む（Ｂａｔｔｌｅｓｅｔａｌ．，２０１７）。ヒト呼吸器合胞体ウイルスＦ（ＲＳＶＦ）及びインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）等の他のクラスＩ融合タンパク質については、三量体は不安定であり、一過性で広がって開く、または「呼吸する」ことが可能であることが示されている（Ｂａｎｇａｒｕｅｔａｌ．，２０１９、Ｗａｔａｎａｂｅｅｔａｌ．，２０１９、Ｇｉｌｍａｎｅｔａｌ．，２０１９）。最近、ｈＭＰＶＦの三量体境界面を標的とするヒト抗体が記載され、融合前ｈＭＰＶＦがインビボでこの一過性の開口を経ることが示唆されている（Ｈｕａｎｇｅｔａｌ．，２０２０）。膜融合を容易にするために、準安定な融合前Ｆタンパク質は、実質的な立体構造変化を経て、融合ペプチドを遊離させ、宿主の細胞膜の中へ伸展させる。この不安定なプレヘアピン中間体は、それ自体の上に再度折り重なって、いわゆる融合後（ｐｏｓｔｆｕｓｉｏｎ）立体構造において、Ｎ末端及びＣ末端ヘプタッドリピート（それぞれＨＲＡ及びＨＲＢ）の三量体から構成される高度に安定な６ヘリックスバンドルを形成する（Ｍａｓｅｔａｌ．，２０１６）。ウイルス侵入におけるその必要不可欠な役割を考慮して、ｈＭＰＶに対するワクチン候補は一般に、Ｆタンパク質を含む。換言すれば、ｈＭＰＶに対する潜在的なワクチン接種戦略は、ウイルス感染に必要不可欠であるその融合（Ｆ）糖タンパク質を標的とすることによる。しかしながら、薬物候補を同定するため及びＦタンパク質に対する有効な免疫応答を刺激するために使用され得る、安定化されたＦタンパク質に対する必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００６】
したがって、本明細書では、熱安定性のｈＭＰＶＦの融合前立体構造バリアントが提供される。シスチン（ｃｙｓｔｉｎｅ）変異の対の導入によりジスルフィド結合を導入することで、タンパク質の発現量及び熱安定性が改善された。個々の疎水性、静電相互作用、及び電荷低減の変異もまた有益である。加えて、複数の有益な変異を組み合わせることで、所望のタンパク質特性がさらに改善された。
【０００７】
一実施形態では、本明細書において、（ｉ）配列番号１、２、及び４～７のうちいずれかのアミノ酸１９～４８９、または（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸１９～４８４に対して少なくとも９０％の同一性を有する、メタニューモウイルス（ＭＰＶ）Ｆタンパク質外部ドメインを含む操作されたタンパク質が提供され、該操作されたタンパク質は、配列番号１～７のうちいずれか１つの配列に対して少なくとも１つの変異を含み、該少なくとも１つの変異は、Ｋ１６６、Ｎ３４２、Ａ／Ｄ１８５、Ｋ１８８、Ｔ４９、Ｖ２６２、Ｈ４３５、Ｅ２６、Ｇ４３９、Ｎ４６、Ｌ１５８、Ａ１６１、Ｌ５０、Ｖ１６２、Ｅ５１、Ｒ１６３、Ｖ１０４、Ｎ４５７、Ｌ１１０、Ｎ３２２、Ａ１１３、Ｄ３３６、Ａ１１６、Ａ３３８、Ａ１４０、Ａ１４７、Ｓ２９１、Ｓ４４３、Ｓ２９３、Ｓ４４４、Ｓ３５５、Ｖ４４２、Ｔ３６５、Ｖ４６３、Ｓ２２、Ｇ５３、Ｖ１６９、Ｅ３０５、Ｌ３０２、Ｖ４７、Ａ１５９、Ｔ１２７、Ｎ１５３、Ｇ１２１、Ｉ／Ｆ２５８、Ｇ１０６、Ａ１０７、Ｔ１６０、Ｉ１２８、Ａ１９０、Ｖ１１８、Ｑ４２６、Ｌ１６５、Ｖ１９１、Ｓ１４９、Ｉ１３７、Ｖ／Ｉ１２２、Ｓ１９２、Ｔ３１７、Ｌ１０５、Ｌ１３４、Ａ１１７、Ｓ３４７、Ｇ２６１、Ｉ２６８、Ｓ４７０、Ｌ４７３、Ｓ２６５、Ｌ４６０、Ｆ４８、Ｑ４５５、Ｖ２３１、Ａ３７４、Ｉ２１７、Ｓ３７６、Ｇ３６６、Ｓ１９４、Ｌ２１９、Ａ３４４、Ａ８６、Ｔ１１４、Ｖ１４８、Ｄ４６１、Ｌ６６、Ｌ７３、Ｎ１４５、Ｑ１９５、Ｅ４５３、及び／またはＨ３６８に対応する位置に置換を含む。一部の態様では、操作されたタンパク質は、（ｉ）配列番号１、２、及び４～７のうちいずれかのアミノ酸１９～４８９、または（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸１９～４８４に対して少なくとも９５％の同一性を有する。配列番号１は、ＢＶ－１１５バリアント配列に対応する。配列番号２は、ＪＳＭ－１１４７バリアント配列に対応する。配列番号３は、ＤＷ－１バリアント配列に対応する。配列番号４は、ｈＭＰＶＡ１ＮＬ／１／００株のＦタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＫ６２９６８．２）に対応する。配列番号５は、ｈＭＰＶＡ２ＮＬ／００／１７株のＦタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＪ７０１１５．１）に対応する。配列番号６は、ｈＭＰＶＢ１ＮＬ／１／９９株のＦタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ５２５８４３．１）に対応する。配列番号７は、ｈＭＰＶＢ２ＴＮ／９９／４１９株のＦタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＳ９２８８２．１）に対応する。
【０００８】
一部の態様では、操作されたタンパク質は、Ａ／Ｄ１８５Ｐに対応するプロリン置換を含む。一部の態様では、操作されたタンパク質は、ＲＱＳＲ（配列番号４～７のうちいずれか１つの残基９９～１０２；配列番号９）からＲＲＲＲ（配列番号１～３のうちいずれか１つの残基９９～１０２；配列番号１０）に対応する置換を含む。一部の態様では、操作されたタンパク質は、Ａ／Ｄ１８５Ｐに対応するプロリン置換及びＲＱＳＲ（配列番号４～７のうちいずれか１つの残基９９～１０２；配列番号９）からＲＲＲＲ（配列番号１～３のうちいずれか１つの残基９９～１０２；配列番号１０）に対応する置換を含む。一部の態様では、操作されたタンパク質は、配列番号１～７のうちいずれか１つの残基８７～１０４からＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲ（配列番号８）に対応する置換を含む。
【０００９】
一部の態様では、操作されたタンパク質は、Ｅ２６Ｃ及びＧ４３９Ｃ、Ｎ４６Ｃ及びＬ１５８Ｃ、Ｔ４９Ｃ及びＡ１６１Ｃ、Ｌ５０Ｃ及びＶ１６２Ｃ、Ｅ５１Ｃ及びＲ１６３Ｃ、Ｅ５１Ｃ及びＫ１６６Ｃ、Ｖ１０４Ｃ及びＮ４５７Ｃ、Ｌ１１０Ｃ及びＮ３２２Ｃ、Ａ１１３Ｃ及びＤ３３６Ｃ、Ａ１１６Ｃ及びＡ３３８Ｃ、Ａ１４０Ｃ及びＡ１４７Ｃ、Ｓ２９１Ｃ及びＳ４４３Ｃ、Ｓ２９３Ｃ及びＳ４４３Ｃ、Ｓ２９３Ｃ及びＳ４４４Ｃ、Ｓ３５５Ｃ及びＶ４４２Ｃ、Ｔ３６５Ｃ及びＶ４６３Ｃ、Ｓ２２Ｃ及びＨ４３５Ｃ、Ｇ５３Ｃ及びＫ１６６Ｃ、Ｇ５３Ｃ及びＶ１６９Ｃ、Ｅ３０５Ｃ及びＮ４５７Ｃ、Ｓ２９１Ｃ及びＬ３０２Ｃ、Ｖ４７Ｃ及びＡ１５９Ｃ、Ｔ１２７Ｃ及びＮ１５３Ｃ、Ｇ１２１Ｃ及びＩ／Ｆ２５８Ｃ、Ｆ４８Ｃ及びＴ１６０Ｃ、ならびに／またはＴ３６５Ｃ及びＱ４５５Ｃに対応するシステイン置換の対を含む、操作されたジスルフィド結合を含む。一部の態様では、操作されたタンパク質は、Ａ１１６Ｃ及びＡ３３８Ｃ、Ｔ３６５Ｃ及びＶ４６３Ｃ、Ｔ１２７Ｃ及びＮ１５３Ｃ、Ｔ３６５Ｃ及びＱ４５５Ｃ、Ｖ１０４Ｃ及びＮ４５７Ｃ、Ｌ１１０Ｃ及びＮ３２２Ｃ、またはＡ１４０Ｃ及びＡ１４７Ｃに対応するシステイン置換の対を含む、操作されたジスルフィド結合を含む。一部の態様では、操作されたタンパク質は、Ａ１４０Ｃ及びＡ１４７Ｃに対応するシステイン置換の対を含む、操作されたジスルフィド結合を含む。一部の態様では、操作されたタンパク質は、Ｖ１０４Ｃ及びＮ４５７Ｃに対応するシステイン置換の対を含む、操作されたジスルフィド結合を含む。一部の態様では、操作されたタンパク質は、Ｌ１１０Ｃ及びＮ３２２Ｃに対応するシステイン置換の対を含む、操作されたジスルフィド結合を含む。一部の態様では、操作されたタンパク質は、Ｔ３６５Ｃ及びＶ４６３Ｃに対応するシステイン置換の対を含む、操作されたジスルフィド結合を含む。
【００１０】
一部の態様では、操作されたタンパク質は、Ｌ２１９及び／またはＶ２３１に対応する位置に置換を含む。一部の態様では、操作されたタンパク質は、Ｌ２１９Ｋ及び／またはＶ２３１Ｉに対応する置換を含む。一部の態様では、操作されたタンパク質は、Ｔ１２７Ｃ及びＮ１５３Ｃに対応するシステイン置換の対を含む。一部の態様では、操作されたタンパク質は、Ｌ１１０Ｃ及びＮ３２２Ｃに対応するシステイン置換の対を含む。一部の態様では、操作されたタンパク質は、Ａ１４０Ｃ及びＡ１４７Ｃに対応するシステイン置換の対を含む。一部の態様では、操作されたタンパク質は、Ｇ３６６Ｓに対応する置換を含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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