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公開番号2025081553
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-27
出願番号2025025949,2023031415
出願日2025-02-20,2016-10-19
発明の名称切断高分子量キニノーゲンを検出するイムノアッセイ
出願人武田薬品工業株式会社
代理人個人,個人,個人,個人
主分類G01N 33/53 20060101AFI20250520BHJP(測定;試験)
要約【課題】生体試料中の切断HMWKのレベルを検出する高感度で信頼できるアッセイの開発。
【解決手段】切断高分子量キニノーゲン(HMWK)を高い感度および特異性で検出するイムノアッセイを提供する。この方法は、(i)切断HMWKと特異的に結合する第一の薬剤(例えば、559B-M004-B04などの抗体)が結合した支持要素を準備すること;(ii)(i)の支持要素と、切断HMWKを含有することが疑われる生体試料とを接触させること;(iii)(ii)で得られた支持要素と、標識とコンジュゲートされておりHMWKと結合する第二の薬剤とを接触させること;および(iv)支持要素と直接的または間接的に結合した第二の薬剤の標識から放出されるシグナルを検出して、生体試料中の切断HMWKのレベルを決定することを含む。
【選択図】図9
特許請求の範囲【請求項１】
本願の明細書または図面に記載される発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は米国特許法第１１９条の下、２０１５年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／２４３，５０５号および２０１６年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／３３５，３１１号の利益を主張するものであり、上記出願はそれぞれ、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 1,900 文字）【背景技術】
【０００２】
キニノーゲンは、ブラジキニンおよびカリジンなどのキニンの前駆体である。ヒトのキニノーゲンには、スプライシングバリアントである高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）と低分子量キニノーゲン（ＬＭＷＫ）の２種類がある。ＨＭＷＫは、主として凝固および炎症の補因子として作用し、血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）を介するブラジキニン生成の優先基質となる。
【０００３】
血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）は循環血中の主要なブラジキニン生成酵素である。ｐＫａｌの活性化は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）の疾患病理と関係があるとされている接触系を介して起こる。ｐＫａｌがＨＭＷＫ（一本鎖ポリペプチド）を分解するとブラジキニンおよびジスルフィド結合によって結合した２本のポリペプチド鎖を含む切断型のＨＭＷＫを生じる。Ｃｕｇｎｏら，Ｂｌｏｏｄ（１９９７）８９：３２１３－３２１８。
【０００４】
遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）の発作時には切断ＨＭＷＫがキニノーゲン全体の約４７％に増大し（Ｃｕｇｎｏら，Ｂｌｏｏｄ（１９９７）８９：３２１３－３２１８）、このため切断ＨＭＷＫはＨＡＥ発作をモニターするバイオマーカーである。このため、生体試料中の切断ＨＭＷＫのレベルを検出する高感度で信頼できるアッセイの開発に関心がもたれている。
【発明の概要】
【０００５】
本開示のいくつかの態様は、切断高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）を高い感度および特異性で検出するイムノアッセイを提供する。この方法は、（ｉ）切断ＨＭＷＫと特異的に結合する第一の薬剤（例えば、５５９Ｂ－Ｍ００４－Ｂ０４などの抗体）が結合した支持要素を準備すること；（ｉｉ）（ｉ）の支持要素と、切断ＨＭＷＫを含有することが疑われる生体試料とを接触させること；（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた支持要素と、標識とコンジュゲートされておりＨＭＷＫと結合する第二の薬剤とを接触させること；および（ｉｖ）支持要素と直接的または間接的に結合した第二の薬剤の標識から放出されるシグナルを検出して、生体試料中の切断ＨＭＷＫのレベルを決定することを含む。いくつかの場合には、ＺｎＣｌ
２
の存在下で段階（ｉｉ）を実施し得る。
【０００６】
いくつかの実施形態では、段階（ｉｉ）の前に（ｉ）の支持要素をブロッキング緩衝液とインキュベートする。
【０００７】
いくつかの実施形態では、第二の薬剤は、ＨＭＷＫと結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または２種以上のモノクローナル抗体の混合物である。混合物中の２つ以上のモノクローナル抗体は、ＨＭＷＫの異なるエピトープと結合し得る。いくつかの実施形態では、標識はシグナル放出物質である。いくつかの実施形態では、標識は受容体－リガンド対の要素である。その場合、イムノアッセイは、段階（ｉｖ）の前に、支持要素上に固定化した（ｉｉｉ）の第二の薬剤と、受容体－リガンド対の他方の要素とを接触させることをさらに含み、ここで、他方の要素はシグナル放出物質とコンジュゲートされている。１つの例では、受容体－リガンド対はビオチンとストレプトアビジンである。
【０００８】
本開示の別の態様は、試料中の切断高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）を検出する方法を提供し、この方法は、（ｉ）切断ＨＭＷＫを含有することが疑われる試料と、本明細書に記載されるいずれかの抗体（例えば、５５９Ｂ－Ｍ００４－Ｂ０４）とを接触させること；（ｉｉ）段階（ｉ）で形成された切断ＨＭＷＫと抗体の複合体を測定すること；および（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の結果に基づき試料中の切断ＨＭＷＫのレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＺｎＣｌ
２
の存在下で段階（ｉ）を実施する。いくつかの実施形態では、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または免疫ブロット法を用いて段階（ｉ）を実施する。
【０００９】
本明細書に記載されるいずれかの方法では、試料は、対象（例えば、ヒト患者）から採取した生体試料、例えば血漿試料の血清試料などであり得る。いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のプロテアーゼ阻害剤を含む真空採血管に試料を採取することをさらに含み得る。
【００１０】
本明細書に記載されるいずれかのアッセイ法（例えば、イムノアッセイ）は、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロットアッセイまたはラテラルフローアッセイであり得る。
（【００１１】以降は省略されています）

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