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公開番号2025078105
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-19
出願番号2025005378,2022162025
出願日2025-01-15,2017-12-08
発明の名称CRISPRエフェクターシステムベースの診断法
出願人ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド,マサチューセッツインスティテュートオブテクノロジー,プレジデントアンドフェロウズオヴハーヴァードカレッジ
代理人弁理士法人特許事務所サイクス
主分類C12Q 1/6811 20180101AFI20250422BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】RNAターゲティングエフェクターを利用してアトモル濃度感度によるロバストなCRISPRベースの診断法を提供する。
【解決手段】エフェクタータンパク質と、対応する標的分子に結合するように設計された1つ以上のガイドRNAとを含む検出CRISPRシステム;及びRNAベースのマスキング構築物を含む核酸検出システムが提供される。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
エフェクタータンパク質と、対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡとを含む検出ＣＲＩＳＰＲシステム；及び
ＲＮＡベースのマスキング構築物
を含む核酸検出システム。
続きを表示（約 870 文字）【請求項２】
エフェクタータンパク質と、トリガーＲＮＡに結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡとを含む検出ＣＲＩＳＰＲシステム；
ＲＮＡベースのマスキング構築物；及び
マスキングされたＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位又はマスキングされたプライマー結合部位を含む１つ以上の検出アプタマー
を含むポリペプチド検出システム。
【請求項３】
核酸増幅試薬を更に含む、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
前記標的分子が標的ＤＮＡであり、前記システムが、前記標的ＤＮＡと結合する、且つＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記ＣＲＩＳＰＲシステムエフェクタータンパク質がＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質である、請求項１～４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
前記ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質が１つ以上のＨＥＰＮドメインを含む、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記１つ以上のＨＥＰＮドメインがＲｘｘｘｘＨモチーフ配列を含む、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記ＲｘｘｘＨモチーフがＲ｛Ｎ／Ｈ／Ｋ］Ｘ
１
Ｘ
２
Ｘ
３
Ｈ配列を含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
Ｘ
１
がＲ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、又はＹであり、及びＸ
２
が独立にＩ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＬであり、及びＸ
３
が独立にＬ、Ｆ、Ｎ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、又はＡである、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記ＣＲＩＳＰＲＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質がＣ２ｃ２である、請求項１～９のいずれか一項に記載のシステム。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援研究に関する記載事項
本発明は、国立衛生研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）によって付与された助成金第ＭＨ１００７０６号及び第ＭＨ１１００４９号、及び国防脅威削減局（ＤｅｆｅｎｓｅＴｈｒｅａｔＲｅｄｕｃｔｉｏｎＡｇｅｎｃｙ）によって付与された助成金第ＨＤＴＲＡ１－１４－１－０００６号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
続きを表示（約 4,100 文字）【０００２】
本明細書に開示される主題は、概して、ＣＲＩＳＰＲエフェクターシステムの使用に関連する迅速診断法に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸は、生物学的情報の普遍的なシグネチャである。携帯型プラットフォームで核酸を高感度且つ一塩基特異性で迅速に検出可能であれば、多くの疾患の診断及びモニタリングに革命がもたらされ、有益な疫学的情報が提供され、及び一般化可能な科学的ツールとして役立つ可能性がある。核酸を検出する方法は数多く開発されているが（Ｄｕｅｔａｌ．，２０１７；Ｇｒｅｅｎｅｔａｌ．，２０１４；Ｋｕｍａｒｅｔａｌ．，２０１４；Ｐａｒｄｅｅｅｔａｌ．，２０１４；Ｐａｒｄｅｅｅｔａｌ．，２０１６；Ｕｒｄｅａｅｔａｌ．，２００６）、それらは否応なく感度、特異性、単純さ、及び速さの間でトレードオフ状態に陥る。例えば、ｑＰＣＲ手法は高感度だが費用がかかり、且つ複雑な器具類に頼るため、使用できるのは実験室セッティングで高度な訓練を受けた操作者に限られる。他の手法は、例えば等温核酸増幅法を携帯型プラットフォームと組み合わせる新規方法など（Ｄｕｅｔａｌ．，２０１７；Ｐａｒｄｅｅｅｔａｌ．，２０１６）、ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）セッティングで高い検出特異性を提供するが、感度が低いため、利用は幾分限定的である。核酸診断法が種々の医療適用にとって意味を増しつつあることに伴い、低コストで高い特異性及び感度を提供する検出技術があれば、臨床及び基礎研究のいずれのセッティングにおいても極めて有用となり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様において、本発明は、エフェクタータンパク質及び対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムと；ＲＮＡベースのマスキング構築物と；任意選択で、試料中の標的ＲＮＡ分子を増幅する核酸増幅試薬とを含む核酸検出システムを提供する。別の態様において、実施形態は、エフェクタータンパク質及びトリガーＲＮＡと結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムと、ＲＮＡベースのマスキング構築物と；マスキングされたＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位又はマスキングされたプライマー結合部位を含む１つ以上の検出アプタマーとを含むポリペプチド検出システムを提供する。
【０００５】
更なる実施形態において、本システムは核酸増幅試薬を更に含み得る。核酸増幅試薬は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを含み得る。特定の実施形態では、試料核酸を増幅することによりＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型が得られ、それにより標的ＲＮＡ分子が転写によって作成されてもよい。核酸はＤＮＡであってもよく、本明細書に記載される任意の方法によって増幅される。核酸はＲＮＡであってもよく、本明細書に記載されるとおりの逆転写方法によって増幅される。プライマー結合部位がアンマスキングされるとアプタマー配列が増幅されてもよく、それにより増幅ＤＮＡ産物からトリガーＲＮＡが転写される。標的分子は標的ＤＮＡであってもよく、及び本システムが、標的ＤＮＡと結合する、且つＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを更に含んでもよい。
【０００６】
一例示的実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムエフェクタータンパク質はＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質である。例示的ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質としては、Ｃａｓ１３ｂ及びＣ２ｃ２（現在はＣａｓ１３ａとして知られる）が挙げられる。用語「Ｃ２ｃ２」は、本明細書では「Ｃａｓ１３ａ」と同義的に使用されることは理解されるであろう。別の例示的実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質はＣ２ｃ２である。他の実施形態において、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、及びラクノスピラ属（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）からなる群から選択される属の生物由来であり、又はＣ２ｃ２エフェクタータンパク質は、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｓｈａｈｉｉ）、レプトトリキア・ウエイデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｗａｄｅｉ）、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、クロストリジウム・アミノフィルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、カルノバクテリウム・ガリナルム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、パルディバクター・プロピオニシゲネス（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ）、リステリア・ウェイヘンステファネンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される生物であり、又はＣ２ｃ２エフェクタータンパク質はＬ．ウエイデイ（Ｌ．ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９又はＬ．ウエイデイ（Ｌ．ｗａｄｅｉ）Ｆ０２７９（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質である。別の実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡ又はＤＮＡにおける一塩基変異多型、転写物のスプライス変異体、又はフレームシフト突然変異を検出するように設計される。
【０００７】
他の実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡは、疾患状態の診断指標となる１つ以上の標的分子に結合するように設計される。更に別の実施形態において、疾患状態は、感染症、臓器疾患、血液疾患、免疫系疾患、癌、脳及び神経系疾患、内分泌疾患、妊娠又は分娩関連疾患、遺伝性疾患、又は環境的に獲得された疾患である。更に別の実施形態において、疾患状態は癌又は自己免疫疾患又は感染症である。
【０００８】
更なる実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡは、癌特異的体細胞突然変異を含む１つ以上の標的分子に結合するように設計される。癌特異的突然変異は薬剤耐性を付与し得る。薬剤耐性突然変異は、イブルチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、クリゾチニブ、トラスツズマブ、ベムラフェニブ、ＲＡＦ／ＭＥＫ、チェックポイント遮断療法、又は抗エストロゲン療法による治療によって誘発され得る。癌特異的突然変異は、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＢＣＲ－Ａｂｌ、ｃ－ｋｉｔ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＥＲ２、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＡＫＴ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＮＲＡＳ、ＲＡＣ１、及びＥＳＲ１からなる群から選択されるタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子に存在し得る。癌特異的突然変異は、ＣＡＳＰ８、Ｂ２Ｍ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＣ１Ａ、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＴＥＴ２、ＡＬＰＫ２、ＣＯＬ５Ａ１、ＴＰ５３、ＤＮＥＲ、ＮＣＯＲ１、ＭＯＲＣ４、ＣＩＣ、ＩＲＦ６、ＭＹＯＣＤ、ＡＮＫＬＥ１、ＣＮＫＳＲ１、ＮＦ１、ＳＯＳ１、ＡＲＩＤ２、ＣＵＬ４Ｂ、ＤＤＸ３Ｘ、ＦＵＢＰ１、ＴＣＰ１１Ｌ２、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ又はＣ、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＭＥＴ、ＡＳＸＬ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＡＬＯＸ１２Ｂ及びＡＬＯＸ１５Ｂからなる群から選択される遺伝子の突然変異、又は全染色体イベントを除く、以下の染色体バンド：６ｑ１６．１－ｑ２１、６ｑ２２．３１－ｑ２４．１、６ｑ２５．１－ｑ２６、７ｐ１１．２－ｑ１１．１、８ｐ２３．１、８ｐ１１．２３－ｐ１１．２１（ＩＤＯ１、ＩＤＯ２を含む）、９ｐ２４．２－ｐ２３（ＰＤＬ１、ＰＤＬ２を含む）、１０ｐ１５．３、１０ｐ１５．１－ｐ１３、１１ｐ１４．１、１２ｐ１３．３２－ｐ１３．２、１７ｐ１３．１（ＡＬＯＸ１２Ｂ、ＡＬＯＸ１５Ｂを含む）、及び２２ｑ１１．１－ｑ１１．２１のいずれかに影響するコピー数の増加であってもよい。
【０００９】
更なる実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡは、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）マーカーを含む１つ以上の標的分子に結合するように設計されてもよい。
【００１０】
更なる実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡは、一塩基変異多型（ＳＮＰ）を含む１つ以上の標的分子に結合するように設計されてもよい。疾患は心疾患であってもよく、及び標的分子はＶＫＯＲＣ１、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ２Ｃ１９であってもよい。
（【００１１】以降は省略されています）

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