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公開番号2025069175
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-30
出願番号2025003800,2021523947
出願日2025-01-09,2019-11-05
発明の名称挿着されている細胞に直接シグナル伝達しない非天然NKG2D受容体
出願人サイフォス、バイオサイエンシズ、インコーポレイテッド,XYPHOS BIOSCIENCES INC.
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C07K 14/705 20060101AFI20250422BHJP(有機化学)
要約【課題】哺乳動物細胞の表面に挿着された非天然NKG2D受容体を提供する。
【解決手段】非天然の改変NKG2D受容体であって、該受容体が、NKG2Dリガンドの非天然の改変α1-α2ドメインに結合するが、天然NKG2Dリガンドには結合せず、哺乳動物細胞に挿着された該改変NKG2D受容体が、改変α1-α2ドメインに結合している異種原子又は分子の細胞への送達のために高親和性の代替受容体として機能し、改変された該NKG2D受容体が、直接哺乳動物細胞を活性化又は哺乳動物細胞にシグナル伝達しない、受容体が提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
非天然の改変ＮＫＧ２Ｄ受容体であって、該受容体が、ＮＫＧ２Ｄリガンドの非天然の改変α１－α２ドメインに結合するが、天然ＮＫＧ２Ｄリガンドには結合せず、哺乳動物細胞に挿着された該改変ＮＫＧ２Ｄ受容体が、改変α１－α２ドメインに結合している異種原子又は分子の細胞への送達のために高親和性の代替受容体として機能し、改変された該ＮＫＧ２Ｄ受容体が、直接哺乳動物細胞を活性化又は哺乳動物細胞にシグナル伝達しない、受容体。
続きを表示（約 1,300 文字）【請求項２】
前記異種分子が、改変α１－α２ドメインによって哺乳動物細胞に送達される場合、哺乳動物細胞上又はその中のそれぞれの受容体サブユニットを介して該細胞を活性化又は該細胞にシグナル伝達できる、請求項１の異種分子。
【請求項３】
前記異種原子又は分子が、改変α１－α２ドメインによって哺乳動物細胞に送達される場合、非天然の改変ＮＫＧ２Ｄ受容体以外の細胞上又は細胞内のいかなる受容体とも独立に、哺乳動物細胞に直接影響を及ぼし得る、請求項１の異種原子又は分子。
【請求項４】
前記異種原子又は分子が、改変α１－α２ドメインによって哺乳動物細胞に送達される場合、哺乳動物細胞によって内在化され得、改変α１－α２ドメインに結合していたか、又は非結合であったかのいずれかの、内在化された異種原子又は分子が、哺乳動物細胞に影響を与える、請求項１の異種原子又は分子。
【請求項５】
前記異種原子又は分子が、改変α１－α２ドメインによって哺乳動物細胞に送達される場合、インビボ、エクスビボ、若しくはインビトロ検出又はイメージングシステムによって検出可能なマーカーを哺乳動物細胞に提供し得る、請求項１の異種原子又は分子。
【請求項６】
共刺激ドメインが、哺乳動物細胞に導入されたエフェクター分子の機能を増強し、エフェクター分子が改変α１－α２ドメインに結合していない、前記共刺激が細胞内で結合している請求項１の非天然の改変ＮＫＧ２Ｄ受容体。
【請求項７】
前記異種原子又は分子が、改変α１－α２ドメインによって哺乳動物細胞に送達される場合、補体依存性高分子攻撃複合体の形成を促進すること等の、エネルギーの放出又は細胞膜の破壊によって細胞に損傷を与え得る、請求項３の異種原子又は分子。
【請求項８】
哺乳動物細胞に挿着されている非天然の改変ＮＫＧ２Ｄ受容体であって、共刺激ドメインが、細胞内で活性のあるＣＤ３－ゼータドメインの存在なしに改変ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合しており、受容体が、ＮＫＧ２Ｄリガンドの、非天然の改変α１－α２ドメインに結合するが、天然ＮＫＧ２Ｄリガンドには結合しない、受容体。
【請求項９】
前記異種原子又は分子が、改変α１－α２ドメインによって哺乳動物細胞に送達される場合、哺乳動物細胞によって内在化され得、改変α１－α２ドメインに結合していたか、又は非結合であったかのいずれかの、内在化された異種原子又は分子が、哺乳動物細胞に影響を与える、異種原子又は分子が結合している請求項８の非天然の改変α１－α２ドメイン。
【請求項１０】
前記異種原子又は分子が、哺乳動物細胞の、標的担持細胞又は標的担持表面への送達を、該哺乳動物細胞が標的表面又は環境に到達するときに、該哺乳動物細胞の活性化に直接つながることなく、促進するターゲティング又はホーミング機能を、該哺乳動物細胞に提供する、異種原子又は分子が結合している請求項８の非天然の改変α１－α２ドメイン。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本出願は、大まかには、哺乳動物細胞に挿着された非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体の非天然外部ドメインであって、該非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合するよう改変され、異種分子がＮＫＧ２Ｄリガンドの改変α１－α２ドメインに結合している非天然ＮＫＧ２Ｄリガンドが該受容体に結合する場合、哺乳動物細胞を直接活性化又は哺乳動物細胞に直接シグナル伝達しない、外部ドメインに関する。
続きを表示（約 16,000 文字）【背景技術】
【０００２】
背景情報
ＮＫＧ２Ｄは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び特定のＴ細胞及びマクロファージの表面上にＩＩ型ホモダイマー内在性タンパク質として発現される活性化受容体である。主に、ストレスを受けている細胞の表面上で発現されているその８の天然リガンドのうちの１に結合したときに、ＮＫＧ２ＤはＮＫ細胞を活性化して、ストレスを受けた細胞を傷害し、または、Ｔ細胞上の場合、リガンドに占有されたＮＫＧ２Ｄは活性化Ｔ細胞を同時刺激して、そのエフェクター機能を実行する。ヒト天然ＮＫＧ２Ｄの外部ドメイン、その可溶性天然リガンドのいくつか、及び、いくつかの場合、可溶性リガンド及び受容体外部ドメインの結合複合体について、三次元構造が解明されている。ＮＫＧ２Ｄリガンドのモノマーα１－α２ドメインは、天然ＮＫＧ２Ｄホモダイマーの２の外部ドメインに特異的に結合する。
【発明の概要】
【０００３】
発明の要旨
本開示は、哺乳動物の細胞表面に挿着された非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体であって、該非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合するように改変されたＮＫＧ２Ｄリガンドの同族非天然α１－α２ドメインが該非天然受容体に結合する場合、該受容体が該細胞に直接シグナル伝達又は該細胞を直接活性化しない、受容体に関する。ＮＫＧ２Ｄリガンドの非天然α１－α２ドメインには、ポリペプチド、いくつかの実施形態においてはサイトカイン又は改変サイトカイン、抗体又は抗体の断片を含む異種原子又は分子が結合していてよい。細胞の直接活性化又は細胞への直接シグナル伝達は、挿着された非天然ＮＫＧ２Ｄ受容体によって媒介されず、免疫学的シナプスが生じた場合でも起こらない。
図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１Ａ～１Ｂ：（図１Ａ）ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ（配列番号１８）及びＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ（配列番号２５）非天然バリアントとの天然ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ外部ドメイン（配列番号１７）のアラインメント。Ｙ１５２及びＹ１９９の位置を示し、そして非天然バリアント中に存在する変異残基を灰色で強調する。（図１Ｂ）天然／野生型ＵＬＢＰ２の
【０００５】
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69
【０００６】
及びＵＬＢＰ２の非天然バリアント（ＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗ（配列番号１０８）を含む）のアラインメント。非天然ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡまたはＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ受容体への非天然ＵＬＢＰ２バリアントの結合に重要な残基を灰色で強調する。ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ（ＵＬＢＰ
２．Ｓ３、配列番号１２７）またはＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ（ＵＬＢＰ２．Ｃ、配列番号１１１；ＵＬＢＰ２．Ｒ、配列番号１１３；ＵＬＰＢ２．ＡＡ、配列番号１１５；及びＵＬＢＰ２．ＡＢ、配列番号１１７）に結合する直交性バリアントについて探索したＭ１５４－Ｆ１５９領域及び残基Ｒ８０の位置を示す。
図２：ＡｋｔａＨｉＬｏａｄ１６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上で分析した非天然Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー比較。適正にアセンブルされた材料の移動は、より多い体積で溶出される分離した対称的なピークによって例示され、一方、凝集した材料はより少ない体積でより早く溶出された。改変の部位及び本質を、アミノ酸番号Ｙ１５２、Ｙ１９９、または両方によって示す（図の上部から開始して、配列番号４８、４３、４２、５８、４１、及び４０）。
図３：１つまたは２つのアミノ酸変化を有する非天然Ｆｃ－ｅＮＫＧ２Ｄバリアントのサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを、ＡｋｔａＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬカラム上で分析した。適正にアセンブルされた材料の移動は、より多い体積で溶出される分離した対称的なピークによって例示され、一方、凝集した材料（低振幅のブロードなピークまたは一連のピークによって特徴付けられる）はより少ない体積で溶出された。括弧内の文字は、それぞれ１５２位および１９９位におけるアミノ酸を表す（上部から順に、配列番号５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、および４０）。
図４：Ｆｃ－ｅＮＫＧ２Ｄ候補へのＵＬＢＰ２野生型、ＭＩＣｗｅｄ－及びＭＩＣ２５－リツキシマブＭｉｃＡｂｏｄｙのＥＬＩＳＡ結合。凡例を図の上部に示すが、曲線の多くは重なっているので、各々のグラフにおいて個々の曲線にラベルも付した。
図５：野生型リガンドへのｅＮＫＧ２Ｄバリアントの結合。野生型リガンド（全てＦｃ融合物フォーマット）をＯｃｔｅｔＡＨＣバイオセンサー上に捕捉し、そしてＦｃ融合物としての天然ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄ．Ｙ１５２Ａ、またはｅＮＫＧ２Ｄ５（Ｙ１５２Ａ／Ｙ１９９Ｆ）の各々を３００ｎＭから０．４１ｎＭまでタイトレートした。最大結合応答をＯｃｔｅｔによって定量した（各々グラフについて縦軸が異なることに留意のこと）。
図６：Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの選択的結合及びＦｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔへの低下または消失した結合を確認するための個別のファージバリアントのタイトレーションＥＬＩＳＡ。変異を図２２において詳述する。
図７：ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ、及びＮＫＧ２Ｄ．ＡＦに結合する４の非天然α１－α２ＵＬＢＰ２バリアントＭｉｃＡｂｏｄｙのＥＬＩＳＡデータ。Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄバリアントを捕捉物質として使用した。ＭｉｃＡｂｏｄｙをＨＲＰ結合抗ヒトκ中でタイトレートし、そしてそれを用いて検出した。
図８：ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、及びＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド－ＭＨＣＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣ４．０Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡスーパータイプ代表に対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４～１５９）を上流及び下流の９残基とともに入れ（合計２４残基）、９マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩポケットに結合し（％順位＜０．５を有するとして定義される）、それゆえ提示される強い見込みを有すると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する（％順位＜２）。更なる詳細については実施例５本文を参照のこと。
図８：ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、及びＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド－ＭＨＣＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣ４．０Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡスーパータイプ代表に対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４～１５９）を上流及び下流の９残基とともに入れ（合計２４残基）、９マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩポケットに結合し（％順位＜０．５を有するとして定義される）、それゆえ提示される強い見込みを有すると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する（％順位＜２）。更なる詳細については実施例５本文を参照のこと。
図９：ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、及びＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４～１５９）を上流及び下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
図９：ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、及びＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４～１５９）を上流及び下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
図９：ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、及びＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４～１５９）を上流及び下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
図９：ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、及びＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４～１５９）を上流及び下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
図９：ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、及びＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４～１５９）を上流及び下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
図９：ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、及びＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４～１５９）を上流及び下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
図９：ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、及びＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４～１５９）を上流及び下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
図９：ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、及びＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４～１５９）を上流及び下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
図９：ＵＬＢＰ２．Ｃ（配列番号１１１）、ＵＬＢＰ２．Ｒ（配列番号１１３）、ＵＬＢＰ２．ＡＡ（配列番号１１５）、及びＵＬＢＰ２．ＡＢ（配列番号１１７）を、野生型ＵＬＢＰ２（配列番号４）と比較してのペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性の変化について、ＮｅｔＭＨＣＩＩ２．３Ｓｅｒｖｅｒを使用し、ＨＬＡ―ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰに対してクエリーして検討した。インプット配列については、各々のバリアントについての可変領域（図１Ｂにおけるアラインメントに従った残基１５４～１５９）を上流及び下流の１５残基とともに入れ（合計３６残基）、１５マーペプチドウインドウを予測免疫原性について検討した。濃灰色四角は、ＭＨＣＩＩポケットに結合し、それゆえ提示されそして免疫原性でありそうであると強く予測されるペプチドに対応する。淡灰色四角は、予測される弱い結合体に対応する。
図１０Ａ～１０Ｂ：天然ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ、及びＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの、ＵＬＢＰ２．ｗｔ（野生型）、ＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗ（野生型ＮＫＧ２Ｄに対する増強された親和性を有する）、ＵＬＰＢ２．Ｓ３（ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ選択された直交性バリアント）、またはＵＬＢＰ２．Ｒ（ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ選択された直交性バリアント）を含むリツキシマブ－ＭｉｃＡｂｏｄｙのＥＬＩＳＡ測定された結合。（図１０Ａ）ＥＬＩＳＡ曲線。より高い濃度でのいくつかのアッセイについての４５８ｎｍ吸収の低下は、ＴＭＢ－ＵｌｔｒａＥＬＩＳＡ発色試薬の沈殿に起因して、より高い濃度の高親和性係合物（ｅｎｇａｇｅｒ）についてしばしば見られるアーチファクトである。（図１０Ｂ）（Ａ）における曲線に基づいてＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍにおいて決定されたＥＣ５０値（ｎＭで報告する）。ｎｄ＝増大した濃度と結合との間の関係の欠如に起因して決定されず。
図１１Ａ～１１Ｃ：形質導入されていないかまたは、ＣＤ８ａヒンジ／膜貫通ドメイン並びに細胞内４－１ＢＢ及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインからなるＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ、若しくはＮＫＧ２Ｄ．ＡＦＣＡＲ構築物を用いて形質導入されたかのいずれかのＣＤ８エフェクター細胞を用いたインビトロ細胞溶解アッセイ。標的細胞にカルセインを前負荷し、そして漸増するエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でエフェクター細胞に曝露した。放出されたカルセインを５時間後に定量した。（図１１Ａ）ＨｅＬａ細胞の細胞溶解。（図１１Ｂ）表面ＵＬＢＰ１を過剰発現するようにトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の溶解。（図１１Ｃ）その表面上に非天然ＵＬＢＰ２．Ｒを発現するＨｅＬａ細胞の細胞溶解。エラーバーは、実験における技術的複製物の標準偏差に対応する。
図１２Ａ～１２Ｂ：ＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲＣＤ８Ｔ細胞による腫瘍株のＭｉｃＡｂｏｄｙ指図細胞溶解。（図１２Ａ）Ｒａｍｏｓ細胞（リツキシマブの標的であるＣＤ２０を発現する）にカルセインを前負荷し、そして漸増濃度のＵＬＢＰ２．Ｓ２またはＵＬＢＰ２．Ｒリツキシマブ－Ｍｉｃａｂｏｄｙのいずれかとともに２０：１のＥ：Ｔ比でＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－またはＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ細胞に曝露した。２時間の共インキュベーションの後に細胞溶解のレベルを定量した。（図１２Ｂ）ヒトＨｅｒ２を発現するようにトランスフェクトしたマウス腫瘍株ＣＴ２６を、Ｒａｍｏｓ細胞と並行して細胞溶解標的として使用した。ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ－ＣＡＲＣＤ８Ｔ細胞に飽和濃度（５ｎＭ）のリツキシマブ－ＵＬＢＰ２．Ｒ、トラスツズマブ－ＵＬＢＰ２．Ｒ、または２のＭｉｃＡｂｏｄｙの等モル混合物を前付与した。非結合ＭｉｃＡｂｏｄｙを洗浄によって除去し、そしてＣＤ８細胞を標的細胞に２の異なるＥ：Ｔ比で添加した。２時間後に細胞溶解を測定した。
図１３Ａ～１３Ｄ：ＭｉｃＡｂｏｄｙ及びＭｉｃＡｄａｐｔｏｒフォーマットの候補の説明。（図１３Ａ）ＭｉｃＡｂｏｄｙ及びＭｉｃＡｄａｐｔｏｒ試薬の開発において利用されるさまざまな抗体Ｆｃバリアントには、（ａ）野生型ヒトＩｇＧ１Ｆｃ、（ｂ）ＦｃをＡＤＣＣ欠損にする２の変異、及び（ｃ）ＡＤＣＣ欠損変異も含有するヘテロ二量体Ｆｃ分子の生成を可能にする、それぞれのＦｃ―Ｆｃ１又はＦｃ２―における静電ステアリング変異（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇｍｕｔａｔｉｏｎ）が含まれる。（図１３Ｂ）直交性リガンドを（ａ）重鎖又は（ｂ）軽鎖のＣ末端に融合させてＭｉｃＡｂｏｄｙ試薬を生成する方法の例。（図１３Ｃ）抗体成分を含まない直接の直交性リガンド融合物を伴うＭｉｃＡｄａｐｔｏｒの例。（図１３Ｄ）血清安定性を増強するためにヒトＩｇＧ１Ｆｃとの関連で生成され得るさまざまなＭｉｃＡｄａｐｔｏｒ分子の説明であり、異種カーゴ又は直交性リガンドのいずれかについての所望の分子の価数に応じて、ヘテロ二量体－Ｆｃ変異を含む（ａ、ｂ、ｃ、本文及び図の説明では「Ｆｃ１／Ｆｃ２」と表記）か、又は含まない（ｄ、ｅ）場合がある。これは、所望のカーゴ、価数、及び機能性（ｆ、ｇ）によっては完全な抗体構造を利用することも含み得、重鎖又は軽鎖のいずれかの融合物であり得る。
図１４：ＣＡＲ構築物、サイレントＣＡＲ、及び他のＣＡＲバリアントの模式図。各構築物についての配列番号を表示。
図１５Ａ～１５Ｃ：ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲを発現するＣＤ８Ｔ細胞へのサイトカイン融合物の選択的送達。（図１５Ａ）ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ－ＣＡＲ（配列番号１５１）又はＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ配列番号１５３）のいずれかを発現するＣＤ８細胞を３０又は３００ＩＵｅ／ｍＬの組換えヒトＩＬ２（ｒｈＩＬ２）又はＩＬ１５（ｒｈＩＬ１５）、又は変異型－ＩＬ２／－ＩＬ１５直交性リガンドの直接の融合物又はヘテロ二量体Ｆｃ（Ｆｃ１／Ｆｃ２）との関連での融合物の変形に曝露した。３日後、ＷＳＴ細胞増殖試薬により増殖を定量化した。ここでのデータは、サイトカインなしのコントロールに対して正規化して示す。（図１５Ｂ）ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲをコードするベクターで形質導入したヒトＴ細胞を様々なリガンド－サイトカイン融合物分子に７日間曝露し、培養物中のＧＦＰ＋ＣＡＲ－細胞のパーセンテージを経時的に追跡した。（図１５Ｃ）直交性リガンドは、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲ細胞へのＩＬ２１及び変異体ＩＬ２１試薬の送達を増強し、ＷＳＴアッセイによって決定されるように、非形質導入細胞と比較して、３日間の培養にわたって、それらの増幅を促進する。サイトカイン又はサイトカイン－ＭｉｃＡｄａｐｔｏｒのＩＵｅ／ｍＬを、横軸の説明中の括弧内に示す。ＭｉｃＡｄａｐｔｏｒの配列番号については、図２４を参照。
図１６Ａ～１６Ｃ：細胞への直交性リガンド－サイトカイン－融合物の送達の促進におけるＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ外部ドメイン単独の十分性を調査するデータ。（図１６Ａ）ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ外部ドメイン単独（配列番号１５７）は、リツキシマブ－ＵＬＢＰ２．Ｓ３ＭｉｃＡｂｏｄｙ（配列番号９８及び１２９）によるＲａｍｏｓ細胞の殺傷を指図することができなかった。（図１６Ｂ）様々なサイトカイン試薬への３日間の曝露後のＷＳＴ増殖アッセイ。（図１６Ｃ）ＷＳＴ増殖アッセイにより、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ＣＡＲの直交性リガンドとの係合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、細胞増殖を促進するのには不十分（但し、融合サイトカイン又はサイトカイン変異体の非存在下で）であることが実証された。ＭｉｃＡｄａｐｔｏｒの配列番号については、図２４を参照。サイトカイン及びサイトカイン－ＭｉｃＡｄａｐｔｏｒのＩＵＥ／ｍＬ量を、横軸の説明中の括弧内に示す。
図１７Ａ～１７Ｃ：（図１７Ａ）示したサイトカイン又はサイトカイン－ＭｉｃＡｄａｐｔｏｒとの３日間のインキュベーション後の、様々な共刺激ドメイン変異体（配列番号１６１、１６３、及び１６５）のＷＳＴ増殖アッセイ。（図１７Ｂ）リツキシマブ－ＵＬＢＰ２．Ｓ３ＭｉｃＡｂｏｄ（配列番号９８及び１２９）の存在下で、カルセインをロードしたＲａｍｏｓ標的細胞を効果的に溶解するそれらの能力について調べた同一の共刺激ドメインＣＡＲ変異体。（図１７Ｃ）サイトカイン試薬との３日間のインキュベーション後のＷＳＴアッセイによって評価された通り、ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ外部ドメイン（ＮＫＧ２Ｄ．ＹＡ－ｅｃｄ）と完全なＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＡＲとの共発現は、増殖を促進するのに十分である。ＭｉｃＡｄａｐｔｏｒの配列番号については、図２４を参照。
図１８：サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定された、候補の非天然Ｆｃ－ｅＮＫＧ２Ｄバリアントの変異及びタンパク質凝集特性のまとめ。
図１９：ＭＩＣｗｅｄ－ＭｉｃＡｂｏｄｙまたはＭＩＣ２５－ＭｉｃＡｂｏｄｙのいずれかによる野生型ＮＫＧ２Ｄ結合に対して正規化されたｅＮＫＧ２Ｄバリアントの飽和百分率（Ｒｍａｘ）。野生型Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ及び各々のＦｃ－ｅＮＫＧ２Ｄ受容体をＡＨＣバイオセンサー上に捕捉し、次いで２０ｎＭのトラスツズマブ特異的ＭｉｃＡｂｏｄｙに曝露した。解離速度をモニターし、そしてＦｃ－ｅＮＫＧ２Ｄ融合物のＲｍａｘ値を順位付けした。試験しなかったサンプル（ｎｔ）は、激しい凝集、または発現されたか若しくはＳＥＣ分画後に回収された材料の不十分な量のいずかに起因した。
図２０：図３に示すＦｃ－ｅＮＫＧ２ＤＥＬＩＳＡについてのＥＣ５０値（ｎＭ）。ｎｔ＝試験せず；ｎｂ＝結合なし、または３００ｎＭでさえ非常に低い結合で、ＥＣ５０値算出されず。
図２１：スポットＥＬＩＳＡによって確認した、天然ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔに対比してＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの選択的結合を有するファージクローンをもたらしたＵＬＢＰ２内の組み合わせ変異のサブセット。変異を、選択されたファージの中での出現頻度によって順位付けした。
図２１：スポットＥＬＩＳＡによって確認した、天然ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔに対比してＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへの選択的結合を有するファージクローンをもたらしたＵＬＢＰ２内の組み合わせ変異のサブセット。変異を、選択されたファージの中での出現頻度によって順位付けした。
図２２：リツキシマブ－ＭｉｃＡｂｏｄｙフォーマットのＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ選択されたＵＬＢＰ２バリアントの特異性は、定量的ＥＬＩＳＡにより、ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦへのその結合を保持した。各々のＵＬＢＰ２バリアントの特異的アミノ酸改変を、Ｆｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ＡＦ融合物に対比したＦｃ－ＮＫＧ２Ｄ．ｗｔ融合物へのその結合の比として示す。ＵＬＢＰ２のアミノ酸残基の位置は図１Ｂのものである。
図２３：Ｙ１５２Ａ特異的ファージクローンをもたらした、ＵＬＢＰ２．Ｒ８０Ｗ（図１Ｂ；配列番号１０８）の表示するアミノ酸位置における、選択された変異。
図２４：ＭｉｃＡｄａｐｔｏｒの配列番号及び一過性トランスフェクションからの精製方法。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
免疫系のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び特定の（ＣＤ８＋αβ及びγδ）Ｔ細胞は、ヒト及び他の哺乳動物において、新生物及び感染細胞に対する第一線の生得的な防御として重要な役割を有している（Ｃｅｒｗｅｎｋａ，Ａ．，ａｎｄＬ．Ｌ．Ｌａｎｉｅｒ．２００１．ＮＫｃｅｌｌｓ，ｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：４１－４９）。ＮＫ細胞及び特定のＴ細胞は、標的細胞の認識及び病態細胞に対する生得的な防御の活性化を担う顕著なホモダイマー表面免疫受容体であるＮＫＧ２Ｄをその表面上に示す（Ｌａｎｉｅｒ，ＬＬ，１９９８．ＮＫｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：３５９－３９３；ＨｏｕｃｈｉｎｓＪＰｅｔａｌ．１９９１．ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＮＫＧ２，ａｆａｍｉｌｙｏｆｒｅｌａｔｅｄｃＤＮＡｃｌｏｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｔｙｐｅＩＩｉｎｔｅｇｒａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓｏｎｈｕｍａｎＮＫｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１０１７－１０２０；Ｂａｕｅｒ，Ｓｅｔａｌ．，１９９９．ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＫｃｅｌｌｓａｎｄＴｃｅｌｌｓｂｙＮＫＧ２Ｄ，ａｒｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＭＩＣＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：７２７－７３０）。ヒトＮＫＧ２Ｄ分子は、その８の異なる同族リガンドに結合するＣ型レクチン様細胞外（外部）ドメインを有しており、最も研究されているリガンドは８４％配列同一または相同のモノマーＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ（主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ鎖関連糖タンパク質（ＭＩＣ）の多型アナログ）である（Ｗｅｉｓｅｔａｌ．１９９８．ＴｈｅＣ－ｔｙｐｅｌｅｃｔｉｎｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙｏｆｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：１９－３４；Ｂａｈｒａｍｅｔａｌ．１９９４．ＡｓｅｃｏｎｄｌｉｎｅａｇｅｏｆｍａｍｍａｌｉａｎＭＨＣｃｌａｓｓＩｇｅｎｅｓ．ＰＮＡＳ９１：６２５９－６２６３；Ｂａｈｒａｍｅｔａｌ．１９９６ａ．ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｈｕｍａｎＭＨＣｃｌａｓｓＩＭＩＣＡｇｅｎｅ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４４：８０－８１；ＢａｈｒａｍａｎｄＳｐｉｅｓＴＡ．１９９６．ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｈｕｍａｎＭＨＣ
ｃｌａｓｓＩＭＩＣＢｃＤＮＡ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４３：２３０－２３３）。ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの非病態的発現は、一部の腸上皮、ケラチノサイト、内皮細胞及び単球に制限されているが、これらのＭＩＣタンパク質の異常な表面発現が、増殖、酸化及び熱ショックのような多くの型の細胞ストレスに応答して生じ、そして細胞を病態的と特徴付ける（Ｇｒｏｈｅｔａｌ．１９９６．Ｃｅｌｌｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｈｕｍａｎＭＨＣｃｌａｓｓＩｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＧＩｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．ＰＮＡＳ９３：１２４４５－１２４５０；Ｇｒｏｈｅｔａｌ．１９９８．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄ
ｕｃｅｄＭＨＣｍｏｌｅｃｕｌｅｓｂｙｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ γδ Ｔｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２７９：１７３７－１７４０；Ｚｗｉｒｎｅｒｅｔａｌ．１９９９．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＩＣＡｂｙｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓａｎｄｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｌ．６０：３２３－３３０）。ＭＩＣタンパク質の病態的発現はまた、いくつかの自己免疫疾患に関与しているようである（Ｒａｖｅｔｃｈ，ＪＶａｎｄＬａｎｉｅｒＬＬ．２０００．ＩｍｍｕｎｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＲｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２９０：８４－８９；Ｂｕｒｇｅｓｓ，ＳＪ．２００８．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．４０：１８－３４）。多型ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのようなＮＫＧ２Ｄリガンドの差次的調節は、所望されない攻撃から健常細胞を依然として防御しながら広範な緊急の合図を同定しそれに応答するための手段を免疫系に提供するために重要である（ＳｔｅｐｈｅｎｓＨＡ，（２００１）ＭＩＣＡａｎｄＭＩＣＢｇｅｎｅｓ：ｃａｎｔｈｅｅｎｉｇｍａｏｆｔｈｅｉｒｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｂｅｒｅｓｏｌｖｅｄ？ＴｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎｏｌ．２２：３７８－８５；Ｓｐｉｅｓ，Ｔ．２００８．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆ
ＮＫＧ２Ｄｌｉｇａｎｄｓ：ａｐｕｒｐｏｓｅｆｕｌｂｕｔｄｅｌｉｃａｔｅａｆｆａｉｒ．ＮａｔｕｒｅＩｍｍｕｎｏｌ．９：１０１３－１０１５）。
【０００８】
ウイルス感染は、ＭＩＣタンパク質発現の一般的な誘導因子であり、ＮＫまたはＴ細胞の攻撃のためにウイルス感染細胞を同定する（Ｇｒｏｈｅｔａｌ．１９９８；Ｇｒｏｈｅｔａｌ．２００１．Ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆＣＤ８＋ αβＴｃｅｌｌｓｂｙＮＫＧ２ＤｖｉａｅｎｇａｇｅｍｅｎｔｂｙＭＩＣｉｎｄｕｃｅｄｏｎｖｉｒｕｓ－ｉｎｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２５５－２６０；Ｃｅｒｗｅｎｋａ，Ａ．，ａｎｄＬ．Ｌ．Ｌａｎｉｅｒ．２００１）。事実、その宿主細胞上でのそのような攻撃を回避するために、サイトメガロウイルス及び他のウイルスは、自然免疫系による標的化から逃避するために、それが感染する細胞の表面上でのＭＩＣタンパク質の発現を防止する進化した機構を有する（Ｌｏｄｏｅｎ，Ｍ．，Ｋ．Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｊ．Ａ．Ｈａｍｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａｒａｓｅ，Ｊ．Ｐ．Ｈｏｕｃｈｉｎｓ，Ｅ．Ｓ．Ｍｏｃａｒｓｋｉ，ａｎｄＬ．Ｌ．Ｌａｎｉｅｒ．２００３．ＮＫＧ２Ｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄＮＫｃｅｌｌｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｉｓｉｍｐａｉｒｅｄｂｙｇｐ４０ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆＲＡＥ－１ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１２４５－１２５３；Ｓｔｅｒｎ－Ｇｉｎｏｓｓａｒｅｔａｌ．，（２００７）Ｈｏｓｔｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｂｙ
ｖｉｒａｌｍｉＲＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３１７：３７６－３８１；Ｓｔｅｒｎ－Ｇｉｎｏｓｓａｒｅｔａｌ．，（２００８）ＨｕｍａｎｍｉｃｒｏＲＮＡｓｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｔｈｅｒｅｃｅｐｔｏｒＮＫＧ２Ｄ．ＮａｔｕｒｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９：１０６５－７３；Ｓｌａｖｕｌｊｉｃａ，ＩＡＢｕｓｃｈｅ，Ｍ
Ｂａｂｉｃ，ＭＭｉｔｒｏｖｉｃ，ＩＧａｓｐａｒｏｖｉｃ，ＤＣｅｋｉｎｏｖｉｃ，ＥＭａｒｋｏｖａＣａｒ，ＥＰＰｕｇｅｌ，ＡＣｉｋｏｖｉｃ，ＶＪＬｉｓｎｉｃ，ＷＪＢｒｉｔｔ，ＵＫｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ，ＭＭｅｓｓｅｒｌｅ，ＡＫｒｍｐｏｔｉｃａｎｄＳＪｏｎｊｉｃ．２０１０．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｍｏｕｓｅｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｌｉｇａｎｄｆｏｒｔｈｅＮＫＧ２Ｄｒｅｃｅｐｔｏｒｉｓａｔｔｅｎｕａｔｅｄａｎｄｈａｓｉｍｐｒｏｖｅｄｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０：４５３２－４５４５）。
【０００９】
それらのストレスにもかかわらず、肺がんや神経膠芽細胞腫脳がんのもの等の多くの悪性細胞も、ＭＩＣタンパク質の発現を回避し、その結果、自然免疫系から過剰に逃れるた
め、特に攻撃的である可能性がある（Ｂｕｓｃｈｅ，Ａｅｔａｌ．２００６，ＮＫｃｅｌｌｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｊｅｃｔｉｏｎｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｈｕｍａｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｂｙｇｅｎｅｔｉｃｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＨＣｃｌａｓｓＩｃｈａｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅＡ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１７：１３５－１４６；Ｄｏｕｂｒｏｖｉｎａ，ＥＳ，ＭＭＤｏｕｂｒｏｖｉｎ，ＥＶｉｄｅｒ，ＲＢＳｉｓｓｏｎ，ＲＪＯ’Ｒｅｉｌｌｙ，ＢＤｕｐｏｎｔ，ａｎｄＹＭＶｙａｓ，２００３．ＥｖａｓｉｏｎｆｒｏｍＮＫＣｅｌｌＩｍｍｕｎｉｔｙｂｙＭＨＣＣｌａｓｓＩＣｈａｉｎ－ＲｅｌａｔｅｄＭｏｌｅｃｕｌｅｓＥｘｐｒｅｓｓｉｎｇＣｏｌｏｎＡｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６８９１－９９；Ｆｒｉｅｓｅ，Ｍ．ｅｔａｌ．２００３．ＭＩＣＡ／ＮＫＧ２Ｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｌｉｏｍａｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ６３：８９９６－９００６；Ｆｕｅｒｔｅｓ，ＭＢ，ＭＶＧｉｒａｒｔ，ＬＬＭｏｌｉｎｅｒｏ，ＣＩＤｏｍａｉｃａ，ＬＥ
Ｒｏｓｓｉ，ＭＭＢａｒｒｉｏ，ＪＭｏｒｄｏｈ，ＧＡＲａｂｉｎｏｖｉｃｈａｎｄＮＷＺｗｉｒｎｅｒ．（２００８）ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＲｅｔｅｎｔｉｏｎｏｆｔｈｅＮＫＧ２ＤＬｉｇａｎｄＭＨＣＣｌａｓｓＩＣｈａｉｎ－ＲｅｌａｔｅｄＧｅｎｅＡｉｎＨｕｍａｎＭｅｌａｎｏｍａｓＣｏｎｆｅｒｓＩｍｍｕｎｅＰｒｉｖｉｌｅｇｅａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｓＮＫＣｅｌｌ－ＭｅｄｉａｔｅｄＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８０：４６０６－４６１４）。
【００１０】
ＮＫＧ２Ｄに結合したヒトＭＩＣＡの高分解能構造が解明されており、それによってＭＩＣＡのα３ドメインがＮＫＧ２Ｄとの直接的な相互作用を有しないことが実証されている（Ｌｉｅｔａｌ．２００１．ＣｏｍｐｌｅｘｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒＮＫＧ２ＤａｎｄｉｔｓＭＨＣｃｌａｓｓＩ－ｌｉｋｅｌｉｇａｎｄＭＩＣＡ．ＮａｔｕｒｅＩｍｍｕｎｏｌ．２：４４３－４５１；ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｃｏｄｅ１ＨＹＲ）。ＭＩＣＡのα３ドメインは、ＭＩＣＢのもののように、短い可動性のリンカーペプチドによってα１－α２プラットフォームドメインに連結されており、そしてそれ自体はプラットフォームとＭＩＣ発現細胞の表面との間の「スペーサー」として天然に配置されている。ヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢα３ドメインの三次元構造はほぼ同一であり（９４Ｃ－αα’の二乗平均平方根距離＜１Å）、そして機能的に互換的である（Ｈｏｌｍｅｓｅｔａｌ．２００１．ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＳｔｕｄｉｅｓｏｆＡｌｌｅｌｉｃＤｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅＭＨＣＣｌａｓｓＩＨｏｍｏｌｏｇＭＩＣＢ，ａＳｔｒｅｓｓ－ＩｎｄｕｃｉｂｌｅＬｉｇａｎｄｆｏｒｔｈｅＡｃｔｉｖａｔｉｎｇＩｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒＮＫＧ２Ｄ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１６９：１３９５－１４００）。
（【００１１】以降は省略されています）

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