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公開番号2025066666
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-23
出願番号2024176731
出願日2024-10-08
発明の名称片方の性のみの個体を産むトランスジェニック非ヒト動物及びその作出方法
出願人国立大学法人京都大学
代理人弁理士法人津国
主分類A01K 67/0275 20240101AFI20250416BHJP(農業;林業;畜産;狩猟;捕獲;漁業)
要約【課題】本発明は、非ヒト動物において雌雄の産み分けを可能とし、かつ生まれてくる個体が組換え遺伝子を持っていないことを可能とする方法、及びこの方法に用いられる片方の性のみの個体を産むトランスジェニック非ヒト動物を提供することを目的とする。
【解決手段】本開示は、X染色体、Y染色体のいずれか一方が、薬剤応答性プロモーターに作動可能に連結された外因性の胚性致死誘導遺伝子を含む、雄のトランスジェニック非ヒト動物に関する。また、本開示は、雌雄産み分け用の雄のトランスジェニック非ヒト動物の作出方法も含む。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
X染色体、Y染色体のいずれか一方が、薬剤応答性プロモーターに作動可能に連結された外因性の胚性致死誘導遺伝子を含む、雄のトランスジェニック非ヒト動物。
続きを表示（約 1,300 文字）【請求項２】
上記薬剤応答性プロモーターが、テトラサイクリン応答性プロモーター、cumate応答性プロモーター、ホルモン応答性プロモーター、及びRSL1応答性プロモーターから成る群より選択される、請求項１に記載の雄のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
X染色体又はY染色体が、薬剤応答性プロモーターに作動可能に連結された外因性の胚性致死誘導遺伝子を含む、雄のトランスジェニック非ヒト動物と、外因性の胚性致死誘導遺伝子を含まない同種の雌の非ヒト動物とを交配させる工程を含む、妊娠非ヒト動物の取得方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法により取得された妊娠非ヒト動物が有する受精卵を、上記プロモーターが応答する薬剤で処理する工程を含む、外因性の胚性致死誘導遺伝子を含まない受精卵の選別方法。
【請求項５】
上記薬剤で処理する工程が、上記妊娠非ヒト動物に上記薬剤を投与する工程、又は上記妊娠非ヒト動物から受精卵を回収し、上記薬剤添加培地で培養する工程である、請求項４に記載の受精卵の選別方法。
【請求項６】
（A1）X染色体が、薬剤応答性プロモーターに作動可能に連結された外因性の胚性致死誘導遺伝子を含む、雄のトランスジェニック非ヒト動物と、外因性の胚性致死誘導遺伝子を含まない同種の雌の非ヒト動物とを交配させる工程、及び
（B1）上記（A1）工程により得られた妊娠非ヒト動物の受精卵を、上記薬剤で処理する工程、を含む、雄の非ヒト動物の作出方法。
【請求項７】
上記（B1）工程が、（A1）工程により得られた妊娠非ヒト動物に上記薬剤を投与する工程、又は（A1）工程により得られた妊娠非ヒト動物から受精卵を回収し、上記薬剤添加培地で培養する工程である、請求項６に記載の雄の非ヒト動物の作出方法。
【請求項８】
（A2）Y染色体が、薬剤応答性プロモーターに作動可能に連結された外因性の胚性致死誘導遺伝子を含む、雄のトランスジェニック非ヒト動物と、外因性の胚性致死誘導遺伝子を含まない同種の雌の非ヒト動物とを交配させる工程、及び
（B2）上記（A2）工程により得られた妊娠非ヒト動物の受精卵を、上記薬剤で処理する工程、
を含む、雌の非ヒト動物の作出方法。
【請求項９】
上記（B2）工程が、（A2）工程により得られた妊娠非ヒト動物に上記薬剤を投与する工程、又は（A2）工程により得られた妊娠非ヒト動物から受精卵を回収し、上記薬剤添加培地で培養する工程である、請求項８に記載の雌の非ヒト動物の作出方法。
【請求項１０】
（A3）X染色体が、薬剤応答性プロモーターに作動可能に連結された外因性の胚性致死誘導遺伝子を含む、雄のトランスジェニック非ヒト動物の精子と、外因性の胚性致死誘導遺伝子を含まない同種の雌の非ヒト動物の卵母細胞とを体外受精させる工程、
（B3）上記（A3）工程によって得られた受精卵を、上記薬剤で処理する工程、及び
（C3）上記（B3）工程において生き残った受精卵を仮親に着床させる工程
を含む、雄の非ヒト動物の作出方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、片方の性のみの個体を産むトランスジェニック非ヒト動物及びその作出方法に関する。
続きを表示（約 6,200 文字）【背景技術】
【０００２】
産業動物である家畜の性比をコントロールすることは、乳牛においては雌、肉牛においては雄、というように目的に合った性を選択でき、畜産経営にとって非常に大きな経済効果をもたらすと予想できる。また、ブタにおいては性成熟期に達した雄は臭みが強く、食肉には適していないため、雄ブタは生後数週齢で去勢されてから肥育される。しかし、去勢には多大な労力が必要となる他、動物福祉団体から非難を浴びる等、社会的問題にもなっている。また、実験動物においても、研究目的によって雌雄の必要数が異なる場合があることから、動物の性比をコントロールできれば、出生時調整や生育後の数調整を行う必要がなくなり、実験動物を有効に活用できるという大きなメリットがある。近年、市場を拡大しているペット産業においても、性の選別は非常に有益である。
【０００３】
雌雄の産み分けに関しては、遺伝子診断技術を用いた受精卵の性判別(非特許文献１：Alfieri et al., 2003)や、DNA量に依存した精子の分離による性判別(非特許文献２：Johnson, 2000)が知られている。しかし、前者では受精卵の採取、PCRによる遺伝子増幅やその後の受精卵移植、後者では精液採取後の細胞分離装置による精子の分離、凍結等、時間と高価な機材を必要とするため、普及は難しいと考えられている。また、細胞がもつ染色体を蛍光染色するFISH法(非特許文献３：Lee et al., 2004)もあるが、受精卵の一部を物理的に切り取って利用することに変わりはなく、受精卵の生存性、保存性、受胎率を低下させる要因となっている。さらに、細胞表面組織適合性Y(H-Y)抗原を使用することにより、ウシ胚の性別判定の精度が向上したという報告(非特許文献４：Veerhuis et al., 1994)がある一方で、この方法には再現性がないという報告もある(非特許文献５：Bredbacka, 1998)。その後の研究では、胚生検(非特許文献６：Harper et al., 1994)と性染色体関連遺伝子のPCRベースのアッセイを使用しているが(非特許文献７：HuaBin et al., 2012)、これらの方法は、一般的に手間がかかり、エラーが発生しやすく、さらに正常な胚の発達を損なう可能性があるという不都合がある。また、雌雄の産み分けをするための他の方法に、Y染色体上にGFP遺伝子をノックインすることで雄の受精卵のみ蛍光が見られることを利用したものもあるが(非特許文献８：Zhao et al., 2019)、この方法も受精卵の採取や、受精卵移植が必要であるという難点がある。また、X染色体にCas9遺伝子がノックインされた雄と、常染色体上に、発生に必須な遺伝子であるTop1を標的とした三種類のgRNAをノックインした雌を交配させることで、産仔を雌のみにできることが報告されている(非特許文献９：Yosef et al., 2019)。また、遺伝子組み換えによりCRISPR Cas9システム（Cas9あるいはgRNA）を持つ両親を用いることで、生まれてくる個体の性比を制御する方法が報告されている（非特許文献１０：C.Douglas et al., Nat. Commun 2021, doi .org/10.1038/s41467 021 27227 2）。しかし、これらの方法で産まれてくる産仔は外来遺伝子を持つため、畜産動物へ適用することには不都合があると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
Alfieri et al., Journal of Cell Science, 2003, 116(11), 2149-2155
Johnson, Sexing Mammalian Sperm for Production of Offspring: the State-of-the-art, Animal Reproduction Science 2000, 60-61, 93-107
Lee et al., Theriogenology, 2004, 62, 1452-1458
Veerhuis et al., Veterinary Immunology and Immunopathology, 1994, 42, 317-330
Bredbacka, Reproduction Nutrition Development,1998,38,605-613
Harper et al., Human Reproduction,1994, 9, 721-724
HuaBin et al., Journal of Animal and Veterinary Advances 2012,11,1847-1852
Zhao et al., Scientific Reports, 2019, 9(1), 1-9.
Yosef et al., EMBO Reports, 2019, 20(8), 1-5
C.Douglas et al., Nat. Commun., 2021, 12, 6926
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、非ヒト動物において雌雄の産み分けを可能とし、かつ生まれてくる個体が組換え遺伝子を持っていないことを可能とする方法、及びこの方法に用いられる片方の性のみの個体を産むトランスジェニック非ヒト動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような状況下、本発明者らが鋭意研究した結果、X染色体上又はY染色体上に、外因性の胚性致死誘導遺伝子を導入し、特定の薬剤存在下で上記胚性致死誘導遺伝子を発現するようにした雄の非ヒト個体を、同系の雌と交配させて得られる受精卵は、概ねその半数は胚性致死誘導遺伝子を有する受精卵となり、この受精卵を特定の薬剤存在下で処理することで細胞死を引き起こし死滅することを見出した。その結果、この雄の染色体のうちの上記胚性致死誘導遺伝子を含まない方の染色体を有する受精卵のみが生き残るため、この方法によると、生まれてくる個体の雌雄をコントロールすることが可能となる。さらに特筆すべきは、生まれてくる個体は組換え遺伝子を持っていないため、実験動物、畜産動物に応用した場合、まったく外来遺伝子の影響のない産み分け個体の作出が可能となる点である。即ち、本発明の要旨は以下のとおりである。
【０００７】
[1]X染色体、Y染色体のいずれか一方が、薬剤応答性プロモーターに作動可能に連結された外因性の胚性致死誘導遺伝子を含む、雄のトランスジェニック非ヒト動物。
[2]上記薬剤応答性プロモーターが、テトラサイクリン応答性プロモーター、cumate応答性プロモーター、ホルモン応答性プロモーター、及びRSL1応答性プロモーターから成る群より選択される、[1]に記載の雄のトランスジェニック非ヒト動物。
[3]X染色体又はY染色体が、薬剤応答性プロモーターに作動可能に連結された外因性の胚性致死誘導遺伝子を含む、雄のトランスジェニック非ヒト動物と、外因性の胚性致死誘導遺伝子を含まない同種の雌の非ヒト動物とを交配させる工程を含む、妊娠非ヒト動物の取得方法。
[4][3]に記載の方法により取得された妊娠非ヒト動物が有する受精卵を、上記プロモーターが応答する薬剤で処理する工程を含む、外因性の胚性致死誘導遺伝子を含まない受精卵の選別方法。
[5]上記薬剤で処理する工程が、上記妊娠非ヒト動物に上記薬剤を投与する工程、又は上記妊娠非ヒト動物から受精卵を回収し、上記薬剤添加培地で培養する工程である、[4]に記載の受精卵の選別方法。
[6]（A1）X染色体が、薬剤応答性プロモーターに作動可能に連結された外因性の胚性致死誘導遺伝子を含む、雄のトランスジェニック非ヒト動物と、外因性の胚性致死誘導遺伝子を含まない同種の雌の非ヒト動物とを交配させる工程、及び
（B1）上記（A1）工程により得られた妊娠非ヒト動物の受精卵を、上記薬剤で処理する工程、を含む、雄の非ヒト動物の作出方法。
[7]上記（B1）工程が、（A1）工程により得られた妊娠非ヒト動物に上記薬剤を投与する工程、又は（A1）工程により得られた妊娠非ヒト動物から受精卵を回収し、上記薬剤添加培地で培養する工程である、[6]に記載の雄の非ヒト動物の作出方法。
[8]（A2）Y染色体が、薬剤応答性プロモーターに作動可能に連結された外因性の胚性致死誘導遺伝子を含む、雄のトランスジェニック非ヒト動物と、外因性の胚性致死誘導遺伝子を含まない同種の雌の非ヒト動物とを交配させる工程、及び
（B2）上記（A2）工程により得られた妊娠非ヒト動物の受精卵を、上記薬剤で処理する工程、
を含む、雌の非ヒト動物の作出方法。
[9]上記（B2）工程が、（A2）工程により得られた妊娠非ヒト動物に上記薬剤を投与する工程、又は（A2）工程により得られた妊娠非ヒト動物から受精卵を回収し、上記薬剤添加培地で培養する工程である、[8]に記載の雌の非ヒト動物の作出方法。
[10]（A3）X染色体が、薬剤応答性プロモーターに作動可能に連結された外因性の胚性致死誘導遺伝子を含む、雄のトランスジェニック非ヒト動物の精子と、外因性の胚性致死誘導遺伝子を含まない同種の雌の非ヒト動物の卵母細胞とを体外受精させる工程、
(B3)上記（A3）工程によって得られた受精卵を、上記薬剤で処理する工程、及び
(C3)上記（B3）工程において生き残った受精卵を仮親に着床させる工程
を含む、雄の非ヒト動物の作出方法。
[11]（A4）Ｙ染色体が、薬剤応答性プロモーターに作動可能に連結された外因性の胚性致死誘導遺伝子を含む、雄のトランスジェニック非ヒト動物の精子と、外因性の胚性致死誘導遺伝子を含まない同種の雌の非ヒト動物の卵母細胞とを体外受精させる工程、
（B4）上記（A4）工程によって得られた受精卵を、上記薬剤で処理する工程、
（C4）上記（B4）工程において生き残った受精卵を仮親に着床させる工程
を含む、雌の非ヒト動物の作出方法。
[12]薬剤応答性プロモーター配列、及び上記プロモーター配列の下流に配置された胚性致死誘導遺伝子、を含む第1発現カセットと、
受精卵で機能するプロモーター配列、上記プロモーター配列の下流に配置された薬剤制御性トランス活性化因子をコードする配列、を含む第２発現カセットと、
を含む、胚性致死誘導遺伝子発現システム。
[13]第1発現カセットが第1ベクターに保持されており、第2発現カセットが第2ベクターに保持されている、[12]に記載の胚性致死誘導遺伝子発現システム。
[14]第1発現カセットと第2発現カセットとが1つのベクターに保持されている、[12]に記載の胚性致死誘導遺伝子発現システム。
[15]受精卵に対し、[12]～[14]に記載のいずれかの胚性致死誘導遺伝子発現システムを導入し、胚培養を行った後、偽妊娠非ヒト動物の子宮に移植して産仔を得ることを含む、雌雄産み分け用の雄のトランスジェニック非ヒト動物の作出方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、非ヒト動物において、生まれてくる個体の雌雄をコントロールすることが可能となる。また、着床前に外因性の胚性致死誘導遺伝子を有する性染色体が受精した受精卵は死滅するため、その分他方の性染色体が受精した受精卵がより多く着床し、必要な性の産子を効率よく得ることが可能となる。さらに特筆すべきは、生まれてくる個体は組換え遺伝子を持っていないため、実験動物、畜産動物に応用した場合、まったく外来遺伝子の影響のない産み分け個体の作出が可能となる点である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図１は、Tet-on-Bax-IRES-mem-AcGFPを挿入した受精卵とコントロール（NT）の受精卵の顕微鏡写真（Bright及びGFP）の図である。
図２は、Tet-on-Bax-IRES-mem-AcGFPを挿入した受精卵とコントロール（NT）の受精卵をDox(+)又はDox(-)培地中で24時間培養した後の顕微鏡写真の図である。
図３は、Tet-on-Baxのノックイン領域を模式的に示した図である。
図４は、受精卵のジェノタイピングの結果を示す図である。
図５は、pBS-Hprt-arm-CAG-EGFPとCas9 RNPを共注入した13個の受精卵の顕微鏡写真（Bright及びGFP）の図である。
図６は、pBS-Hprt-arm-CAG-EGFPとCas9 RNPを共注入した受精卵のうちGFP蛍光が観察された1つの受精卵のジェノタイピングの結果を示す図である。
図７は、X染色体上にTet-on-Baxを持つ遺伝子組み換え雄マウスのジェノタイピングの結果を示す図である。
図８は、X染色体上にTet-on-Baxを持つ遺伝子組み換え雄マウスと野生型雌マウスの交配によって得られた産仔の雌雄の割合を示す図である。
図９は、X染色体上にTet-on-Baxを持つ遺伝子組み換え雄マウスと野生型雌マウスの交配によって得られた産仔の雌雄の割合を示す図である。
図１０は、Tet-on-Baxのノックイン領域として選定した、Ddx3y遺伝子におけるエキソン１とエキソン２の遺伝子内領域を模式的に示す図である。
図１１は、pBS-Dby-arm-CAG-EGFPとCas9 RNPを共注入した22個の受精卵のうちGFP蛍光が観察された10個の受精卵の顕微鏡写真（Bright及びGFP）の図である。
図１２は、pBS-Dby-arm-CAG-EGFPとCas9 RNPを共注入した22個の受精卵のジェノタイピングの結果を示す図である。
図１３は、Y染色体上にTet-on-Baxを持つ遺伝子組み換え雄マウスのジェノタイピングの結果を示す図である。
図１４は、雌雄産み分けマウスの作用に関する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、本明細書において、分子生物学的手法は、特に明記しない限り当業者に公知の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。また、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。
（【００１１】以降は省略されています）

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