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公開番号2025046039
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-02
出願番号2023154186
出願日2023-09-21
発明の名称マイコプラズマ・ホミニス検出用オリゴヌクレオチド及びその用途
出願人東洋紡株式会社,国立大学法人筑波大学
代理人弁理士法人三枝国際特許事務所
主分類C12Q 1/6888 20180101AFI20250326BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】マイコプラズマ・ホミニス検出用オリゴヌクレオチドを提供すること。
【解決手段】以下の(A)又は(B)の塩基配列を有する、マイコプラズマ・ホミニス検出用プローブ:
(A)特定の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも15塩基の塩基配列A1、又は塩基配列A1において1～3個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列A2であって、5’末端又は3’末端のいずれか一方のみが標識されている塩基配列、
(B)前記とは異なる特定の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも15塩基の塩基配列B1、又は塩基配列B1において1～3個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列B2であって、5’末端又は3’末端のいずれか一方のみが標識されている塩基配列。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列を有する、マイコプラズマ・ホミニス検出用プローブ：
（Ａ）配列番号１の３５～７０番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基の塩基配列Ａ１、又は塩基配列Ａ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ａ２であって、５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている塩基配列、
（Ｂ）配列番号２の４５～９５番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基の塩基配列Ｂ１、又は塩基配列Ｂ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｂ２であって、５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている塩基配列。
続きを表示（約 850 文字）【請求項２】
前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列の長さが１５～２５塩基である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列が、配列番号３～８のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列を含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
前記標識が蛍光色素標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項５】
前記標識が、前記プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光する蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項６】
前記標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項７】
前記標識が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項８】
前記標識が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項９】
前記標識されている末端塩基がシトシンである、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１０】
請求項１～９のいずれかに記載のプローブを用いて、試料中に含まれ得るマイコプラズマ・ホミニスを検出する方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれ得るマイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis：ＭＨ）を検出するためのオリゴヌクレオチド等に関する。更に、本発明は、該オリゴヌクレオチドを用いて、試料中に含まれ得るマイコプラズマ・ホミニスを検出する方法及びその方法に用いるための試薬及びキット等に関する。
続きを表示（約 4,300 文字）【背景技術】
【０００２】
性感染症は性的接触によって感染する病気であり、無症状や自覚しない軽症の場合も多く、感染がいつの間にか広がってしまうという問題がある。性感染症を引き起こす原因微生物としては、Chlamydia trachomatis、Neisseria gonorrhoeaeが代表例として挙げられる。更に、その他の原因微生物として、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma hominis、Ureaplasma parvum、Ureaplasma urealyticum、Trichomonas vaginalis、Treponema pallidum等も知られている。
【０００３】
これらの性感染症を引き起こす原因微生物のうち、マイコプラズマ・ホミニスは膣炎、尿道炎、膀胱炎等を引き起こすことが報告されており、これを簡便、迅速、高感度に検出することは臨床診断上重要である。マイコプラズマ・ホミニスの検査方法としては、遺伝子検査が挙げられるが用手による遺伝子検査が主流であり積極的には実施されていない。また、これまで検査が行われていた淋菌、クラミジアに加えマイコプラズマ・ジェニタリウムやマイコプラズマ・ホミニス等その他性感染症起因菌の検査も重要視されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
核酸増幅産物を検出する方法として、融解曲線解析法が知られている。融解曲線解析法は、核酸増幅と検出を別工程で実施することができ、最短３０分間程度で比較的簡便に測定が可能である。さらに蛍光標識核酸プローブを用いた融解曲線解析は、自動分析装置を利用した遺伝子検査にも適合させ易いという利点がある。しかし未だ、融解曲線解析法で高感度にマイコプラズマ・ホミニスを迅速に検出可能な核酸プローブは知られていない。
【０００５】
本発明の１つの目的は、試料中に含まれ得るマイコプラズマ・ホミニスを検出する有用な手法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意研究を行った結果、特定の核酸プローブを用いることで、簡便でありながら、高感度にマイコプラズマ・ホミニスを迅速に検出する方法を見出した。斯かる知見を基に更に検討を重ねることにより、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、以下の態様を包含する。
［項１］以下の（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列を有する、マイコプラズマ・ホミニス検出用プローブ：
（Ａ）配列番号１の３５～７０番目の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基の塩基配列Ａ１、又は塩基配列Ａ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ａ２であって、５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている塩基配列、
（Ｂ）配列番号２の４５～９５番目（例えば５５～９５番目、好ましくは６５～９５番目）の塩基配列若しくはその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基の塩基配列Ｂ１、又は塩基配列Ｂ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｂ２であって、５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている塩基配列。
［項２］前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列の長さが１５～２５塩基である、項１に記載のプローブ。
［項３］前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列が、配列番号３～８のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列を含む、項１又は２に記載のプローブ。
［項４］前記標識が蛍光色素標識である、項１～３のいずれかに記載のプローブ。
［項５］前記標識が、前記プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光する蛍光消光色素による標識である、項１～４のいずれかに記載のプローブ。
［項６］前記標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、項１～５のいずれかに記載のプローブ。
［項７］前記標識が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１～６のいずれかに記載のプローブ。
［項８］前記標識が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１～７のいずれかに記載のプローブ。
［項９］前記標識されている末端塩基がシトシンである、項１～８のいずれかに記載のプローブ。
［項１０］項１～９のいずれかに記載のプローブを用いて、試料中に含まれ得るマイコプラズマ・ホミニスを検出する方法。
［項１１］以下の工程（１）、（２）、及び（３）：
（１）マイコプラズマ・ホミニスを含み得る試料を提供する工程、
（２）工程（１）で提供された試料を含有する反応液において核酸増幅反応を行う工程、及び
（３）工程（２）の核酸増幅反応で得られた１又は複数の核酸増幅産物を、１又は複数の前記プローブを用いて検出する工程、
を含む、項１０に記載の方法。
［項１２］前記工程（２）がＰＣＲ反応により実施され、前記ＰＣＲ反応に用いる核酸増幅酵素が、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである、項１１に記載の方法。
［項１３］前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ又はその変異体である、項１２に記載の方法。
［項１４］前記工程（２）の核酸増幅反応で使用するマイコプラズマ・ホミニス検出用プライマーセットが、
配列番号１の１～４０番目の塩基配列又はその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１８塩基の塩基配列Ｓ１又は前記塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を有する第一のプライマーと、配列番号１の６５～１５０番目の塩基配列又はその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１８塩基の塩基配列Ｓ３又は前記塩基配列Ｓ３において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を有する第二のプライマーとを含むか、或いは
配列番号２の１～５０番目の塩基配列又はその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１８塩基の塩基配列Ｓ５又は前記塩基配列Ｓ５において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ６を有する第一のプライマーと、配列番号２の９０～１４０番目の塩基配列又はその相補的な塩基配列において連続する少なくとも１８塩基の塩基配列Ｓ７又は前記塩基配列Ｓ７において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ８を有する第二のプライマーとを含み、
第二のプライマーが第一のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的である、項１０～１３のいずれかに記載の方法。
［項１５］前記第一のプライマーが、配列番号９～１２のいずれかで示される塩基配列、その相補的な塩基配列、又はそれらの塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列を有し、かつ、前記第二のプライマーが、配列番号１３～１５のいずれかで示される塩基配列、その相補的な塩基配列、又はそれらの塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列を有する、項１４に記載の方法。
［項１６］前記工程（３）の検出する工程が、融解曲線分析により実施される、項１２～１５のいずれかに記載の方法。
［項１７］項１～９のいずれかに記載のプローブを含む、マイコプラズマ・ホミニスを検出するためのキット。
［項１８］項１４又は１５に記載のプライマーセットを含む、マイコプラズマ・ホミニスを検出するためのキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、試料中に含まれ得るマイコプラズマ・ホミニスを検出する有用な手段等を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
試験例１の結果の代表例を示す図（配列番号４で示されるプローブを用いて融解曲線解析を行った場合の検出結果を示すグラフ）である。
試験例２の結果の代表例を示す図（配列番号４で示されるプローブを用いて融解曲線解析を行った場合の検出結果を示すグラフ）である。
試験例３の結果の代表例を示す図（配列番号１１及び１５のプライマーの組合せで行った場合の検出結果を示すグラフ）である。
試験例４の結果の代表例を示す図（配列番号４で示されるプローブを用いて融解曲線解析を行った場合の検出結果を示すグラフ）である。
プライマー及びプローブの設計図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、本明細書中に記載された非特許文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用され、その全体が明細書に組み込まれる。また、本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。本明細書中の「及び／又は」は、リストされる要素のうちのいずれか１つ又は２つ以上の可能な組合せを意味する。本明細書中の「含む」は、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を包含する。
（【００１１】以降は省略されています）

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