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公開番号2025013814
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-28
出願番号2024173372,2021507945
出願日2024-10-02,2019-08-16
発明の名称IN VITROトランスサイトーシスアッセイ
出願人ジェネンテック, インコーポレイテッド
代理人園田・小林弁理士法人
主分類G01N 33/15 20060101AFI20250121BHJP(測定;試験)
要約【課題】分子のトランスサイトーシスを測定するために有用な方法を提供する。特に、治療用抗体分子並びにヒト及び動物におけるFc融合タンパク質のクリアランス速度を評価するためのin vitro受容体依存性トランスサイトーシスアッセイに関する。
【解決手段】分子の薬物動態(PK)パラメーターを決定するための方法であって、生理的pHの条件下、細胞又は複数の細胞を経由する前記分子又は複数の前記分子のトランスサイトーシスの尺度を決定するステップを含む、方法。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
分子の薬物動態（ＰＫ）パラメーターを決定するための方法であって、生理的ｐＨの条件下、細胞又は複数の細胞を経由する前記分子又は複数の前記分子のトランスサイトーシスの尺度を決定するステップを含む、方法。
続きを表示（約 720 文字）【請求項２】
前記ＰＫパラメーターが、前記分子のｉｎｖｉｖｏクリアランスの尺度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＫパラメーターが、前記分子のｉｎｖｉｖｏ半減期の尺度である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記トランスサイトーシスの尺度が、トランスサイトーシスの速度である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスサイトーシスの尺度が、トランスサイトーシスされている分子（１つ又は複数）の量の尺度である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記トランスサイトーシスの尺度が、第１のチャンバー内の溶液から第２のチャンバー内の溶液への分子（１つ又は複数）のトランスサイトーシスを測定することによって決定され、ここで、前記第１及び第２のチャンバーは、細胞単層によって分離され、各チャンバー内の前記溶液は、生理的ｐＨである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞又は複数の細胞が、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、少なくとも１つの異種遺伝子を含む、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの異種遺伝子が、ＦＣＧＲＴ遺伝子及びＢ２Ｍ遺伝子からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が異種細胞表面タンパク質を発現する、請求項２～９のいずれか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１８年８月１７日に出願された米国仮特許出願番号６２／７１９，４０２号に対する優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
続きを表示（約 3,300 文字）【技術分野】
【０００２】
本開示は、分子のトランスサイトーシスを測定するために有用な方法及び組成物に関する。特に、本開示は、ｉｎｖｉｖｏ薬物動態プロファイル、例えば、クリアランス速度、並びに／又は、ＦｃＲｎと相互作用する分子、例えば、治療用抗体、Ｆｃ融合分子及びアルブミンと結合している分子の、半減期を評価するための、ｉｎｖｉｔｒｏ受容体依存性トランスサイトーシスアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、様々な疾患の処置におけるそれらの立証された効果及びそれらの望ましい薬理特性により、世界中で主要なクラスの医薬品製品となってきている。ｍＡｂ薬の好都合な薬理特性の１つは、それらの典型的には長い循環半減期である。バイオ治療製品の長期間の半減期は、ケア費用を低減させ、患者のコンプライアンスを改善する、頻度の少ない投薬及び／又はより低用量の薬物、並びにより低い濃度依存性細胞毒性／有害事象を可能にし得る。
【０００４】
動物及びヒトにおけるｍＡｂ薬の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを理解することにおいては、著しい進歩がなされてきた。多くのｍＡｂ薬が内因性ＩｇＧに類似する同様のＰＫ挙動を示すのに対し、ヒトにおけるｍＡｂ薬の非特異的クリアランス速度の実質的な不均質性は、一般的に観察される。したがって、望ましいＰＫ特性のための臨床候補の評価及び選択は、薬物開発中の重要な初期ステップである。ｉｎｓｉｌｉｃｏ、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏ分析を伴う広範囲の技術が、ヒトにおけるｍＡｂのＰＫ挙動を評価する及び／又は予測するために用いられてきた（Ｄｏｓｔａｌｅｋら、２０１７年、ＭＡｂｓ第９巻（第５号）：第７５６～７６６頁）。しかしながら、動物からヒトへ及びｉｎｖｉｔｒｏアッセイからｉｎｖｉｖｏ読み出しへのＰＫデータの翻訳は、薬物開発者にとっては分かりにくいままである（Ｖｕｇｍｅｙｓｔｅｒら、２０１２年、ＷｏｒｌｄＪＢｉｏｌＣｈｅｍ第３巻（第４号）：第７３～９２頁）。加えて、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウス（Ａｖｅｒｙ、２０１０年）及び非ヒト霊長類（Ｄｅｎｇら、２０１１年、ＤｒｕｇＭｅｔａｂＤｉｓｐｏｓ第３８巻（第４号）：第６００～６０５頁）等のいくつかの動物モデルがｍＡｂのヒトＰＫを予想するために首尾よく使用されてきたが、これらの研究は、典型的には、時間がかかり、高価であり、動物の犠牲を伴う。
【０００５】
動物研究及びｉｎｖｉｔｒｏアッセイからｍＡｂのヒトＰＫを予測する際には、多くの複雑さがある。標的介在性の薬物体内動態（ＴＭＤＤ）は、ｍＡｂの用量依存性ＰＫ挙動に影響を及ぼして、非線形分布及び排除をもたらすことが公知である。ＴＭＤＤの非存在下で、ｍＡｂは、標的非依存性の分子特異的な薬物異化作用を反映した線形排除及び非特異的クリアランス速度を示すことが期待される。ｍＡｂの非特異的クリアランスは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）介在性サベージ経路が主要な役割を果たす細網内皮系におけるリソソーム分解によって主に介在される。構造的に、ＦｃＲｎは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ様分子と相同の膜貫通重鎖（ＦＣＧＲＴ）及び可溶性軽鎖、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）で構成される、ヘテロ二量体である。ＦｃＲｎは、酸性ｐＨ（６．５未満）で内因性ＩｇＧのＦｃドメインと結合するが、中性又は塩基性ｐＨ（７．０超）では最小限のみである。この独自の特性は、ＦｃＲｎがＦｃ含有分子を、細胞への分子の取り込み後に酸性エンドソームにおいて結合することにより分解から保護し、次いで、それらを細胞表面へ輸送して戻し、生理的ｐＨで循環中に放出することを可能にする。対照的に、ＦｃＲｎと結合していない内在化分子は、分解のためにリソソームに向けられる（図６及びＲｏｏｐｅｎｉａｎら、ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．２００７年９月；第７巻（第９号）：第７１５～２５頁を参照）。
【０００６】
Ｆｃ含有タンパク質の半減期を延長する際におけるＦｃＲｎの寄与はよく認識されている（Ｗａｒｄ、２０１５年）が、ヒトにおけるｍＡｂ薬についてのＦｃＲｎ結合とＰＫとの間の相関の欠如の報告（Ｓｕｚｕｋｉ、２０１０年；Ｚｈｅｎｇ、２０１１年；Ｈｏｔｚｅｌ、２０１２年）は、ＦｃＲｎに対する結合親和性が、Ｆｃ含有タンパク質の排除率のための唯一の決定要因ではないことを示唆している。細胞内移動におけるＦｃＲｎの機能を考慮すると、Ｆｃ含有分子／ＦｃＲｎ複合体のエンドソーム選別及び移動の動力学は、ＦｃＲｎ介在性サルベージ機序の全体的効率、及びそれ故、分子の非特異的クリアランス速度に影響を及ぼす可能性が高い。加えて、飲作用又はエンドサイトーシスを介する細胞取り込み及びリソソームにおける分解のプロセスは、ｍＡｂ分解の速度及び程度を決定する際にも役割を果たし得る（Ｇｕｒｂａｘａｎｉ、２０１３年）。最後に、電荷／ｐＩ及びグリコシル化パターン等の生化学的特徴は、ｍＡｂ体内動態に影響を及ぼすと報告されている（Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ、２０１５年；Ｉｇａｗａ、２０１０年；Ｋｈａｗｌｉ、２０１０年）。これらの分子特徴は、ＦｃＲｎとの「真の」相互作用をｉｎｖｉｖｏで変更するように、それら自体がｍＡｂ構造に影響し得るか、又は、内在化のモード／速度並びにリサイクリング及びトランスサイトーシスを含むＦｃＲｎ介在性細胞内移動経路の相対的割合を変更する非特異的細胞表面結合に寄与し得る。
【０００７】
ＩｇＧＦｃ－ＦｃＲｎ相互作用のモデルを作るために、様々なｉｎｖｉｔｒｏアッセイが開発されてきた。これらのアッセイの多くの本質的制限は、細胞、血漿タンパク質及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、並びに、ｍＡｂのリサイクリング、トランスサイトーシス及びリソソーム分解に関連する細胞内移動パラメーターを伴う、非特異的相互作用の非存在である。好ましくは、ｍＡｂクリアランスの予測のためのｉｎｖｉｔｒｏアッセイは、静電相互作用、Ａｂｓの細胞取り込み、ＦｃＲｎとの相互作用、及び分子の細胞内移動の複合効果を評価することができるであろう。しかしながら、ｍＡｂ体内動態にｉｎｖｉｖｏで影響する複数の要因を考慮すると、ｍＡｂ薬のＰＫ挙動を正確にかつ一貫して予測する単純なｉｎｖｉｔｒｏアッセイを開発することは困難である。
【０００８】
動物モデルの開発も同様に、課題を提示している。ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウス（Ａｖｅｒｙ、２０１０年）及び非ヒト霊長類（Ｄｅｎｇ、２０１１年）等の動物モデルがｍＡｂのヒトＰＫを予想するために首尾よく使用されてきたが、これらの研究は、典型的には、時間がかかり、高価であり、動物の犠牲を伴う。さらに、動物研究からヒトへのＰＫ挙動の翻訳は簡単ではなく、一つには、ＦｃＲｎ結合、ＴＭＤＤ、及び抗薬物免疫応答の誘導における、種差による（Ｌｉｕ、２０１８年）。
【０００９】
故に、治療用分子の評価及び選択を支援するために、短時間で及び合理的な費用で行うことができる、治療用分子のｉｎｖｉｖｏＰＫ特性（例えば、クリアランス又は半減期）を予測するための方法が、依然として必要である。
【発明の概要】
【００１０】
本開示は、目的の分子のトランスサイトーシスを測定するために有用な方法及び組成物に関する。特に、本開示は、ｉｎｖｉｖｏ薬物動態プロファイル、例えば、クリアランス速度、並びに／又は、ＦｃＲｎと相互作用する分子、例えば、治療用抗体、Ｆｃ融合分子及びアルブミンと結合している分子の、半減期を評価するための、ｉｎｖｉｔｒｏ受容体依存性トランスサイトーシスアッセイに関する。
（【００１１】以降は省略されています）

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