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公開番号2025012406
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-24
出願番号2023115213
出願日2023-07-13
発明の名称イソアスパラギン酸(Lβ-アスパラギン酸)残基を標識する方法
出願人国立研究開発法人産業技術総合研究所
代理人個人,個人,個人,個人
主分類G01N 27/62 20210101AFI20250117BHJP(測定;試験)
要約【課題】本発明は、アスパラギン酸残基を含む対象ペプチド中のLβ-アスパラギン酸残基を標識する方法に関する。
【解決手段】本発明の方法は、(1)ペプチド中のLα-アスパラギン酸残基を特異的に認識してペプチドを切断するプロテアーゼで、対象ペプチドを処理することによって、Lα-アスパラギン酸残基を有するペプチドを分解する工程、(2)反応系から前記Lα-アスパラギン酸残基を特異的に認識してペプチドを切断するプロテアーゼを除去する工程、(3)Lβ-アスパラギン酸残基を特異的にメチルエステル化し、Lα-アスパラギン酸残基へ変換するメチルトラスフェラーゼにより、Lβ-アスパラギン酸残基をメチルエステル化する工程、ここにおいて、工程(3)を¹⁸O水中で行うことにより、変換後のLα-アスパラギン酸残基のヒドロキシ基が¹⁸Oで標識される、を含む。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
アスパラギン酸残基を含む対象ペプチド中のＬβ－アスパラギン酸残基を標識する方法であって、
（１）ペプチド中のＬα－アスパラギン酸残基を特異的に認識してペプチドを切断するプロテアーゼで、対象ペプチドを処理することによって、Ｌα－アスパラギン酸残基を有するペプチドを分解する工程、
（２）反応系から前記Ｌα－アスパラギン酸残基を特異的に認識してペプチドを切断するプロテアーゼを除去する工程、
および
（３）Ｌβ－アスパラギン酸残基を特異的にメチルエステル化し、Ｌα－アスパラギン酸残基へ変換するメチルトラスフェラーゼにより、Ｌβ－アスパラギン酸残基をメチルエステル化する工程、
ここにおいて、工程（３）を
１８
Ｏ水中で行うことにより、変換後のＬα－アスパラギン酸残基のヒドロキシ基が
１８
Ｏで標識される、
を含む、前記方法。
続きを表示（約 1,500 文字）【請求項２】
工程（３）のＬβ－アスパラギン酸残基を特異的にメチルエステル化し、Ｌα－アスパラギン酸残基へ変換するメチルトラスフェラーゼが、Ｌ－イソアスパラギン酸－メチルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象ペプチドが、３－１００アミノ酸残基の長さのペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対象ペプチドが、タンパク質を分解するプロテアーゼによって、タンパク質を処理することにより得たものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（１）の前に、
（０－ｉ）タンパク質を分解するプロテアーゼによって、対象タンパク質を処理し、対象ペプチドを得る工程、
（０－ｉｉ）反応系から前記タンパク質を分解するプロテアーゼを除去する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（０－ｉ）のタンパク質を分解するプロテアーゼによる処理工程を、ｐＨ８～９の条件下で行う、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質を分解するプロテアーゼが、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、テルモリシン、ペプシン、Ｇｌｕ－Ｃ、Ｇｌｕ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ｌｙｓ－Ｎ、Ａｒｇ－Ｃ、Ｖ８プロテアーゼ、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、およびコラゲナーゼからなる群から選択される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項８】
（１）ペプチド中のＬα－アスパラギン酸残基を特異的に認識してペプチドを切断するプロテアーゼで、対象ペプチドを処理することによって、Ｌα－アスパラギン酸残基を有するペプチドを分解する工程、または、（０－ｉ）タンパク質を分解するプロテアーゼによって、対象タンパク質を処理し、対象ペプチドを得る工程、から、（３）Ｌβ－アスパラギン酸残基を特異的にメチルエステル化し、Ｌα－アスパラギン酸残基へ変換するメチルトラスフェラーゼにより、Ｌβ－アスパラギン酸残基をメチルエステル化する工程、まで同一ｐＨのバッファーを使用する、請求項１－５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
対象タンパク質を分析する方法であって、
（０－ｉ）タンパク質を分解するプロテアーゼによって、対象タンパク質を処理し、対象ペプチドを得る工程、
（０－ｉｉ）反応系から前記タンパク質を分解するプロテアーゼを除去する工程、
（１）ペプチド中のＬα－アスパラギン酸残基を特異的に認識してペプチドを切断するプロテアーゼで、前記対象ペプチドを処理することによって、Ｌα－アスパラギン酸残基を有するペプチドを分解する工程、
（２）反応系から前記Ｌα－アスパラギン酸残基を特異的に認識してペプチドを切断するプロテアーゼを除去する工程、
（３）Ｌβ－アスパラギン酸残基を特異的にメチルエステル化し、Ｌα－アスパラギン酸残基へ変換するメチルトラスフェラーゼにより、Ｌβ－アスパラギン酸残基をメチルエステル化する工程、
ここにおいて、工程（３）を
１８
Ｏ水中で行うことにより、変換後のＬα－アスパラギン酸残基のヒドロキシ基が
１８
Ｏで標識される、
および、
（４）工程（３）で標識されたペプチド中のアスパラギン酸残基を質量分析する工程、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
工程（４）の質量分析は、ＬＣ－ＭＳまたはＭＡＬＤＩ－ＭＳによって行う、請求項９に記載の方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスパラギン酸残基を含む対象ペプチド中のイソアスパラギン酸（Ｌβ－アスパラギン酸）残基を標識する方法に関する。本発明はまた、対象タンパク質中のＬβ－アスパラギン酸残基を分析する方法に関する。
続きを表示（約 1,800 文字）【背景技術】
【０００２】
アミノ酸にはＬ型とＤ型の二つの鏡像異性体がある。長い間、タンパク質を構成するアミノ酸は全てＬ－アミノ酸であると考えられてきた。しかし、近年、Ｄ－アミノ酸を含むタンパク質やペプチドが生体の種々の組織で発見されてきている。
【０００３】
アミノ酸残基の異性化は、タンパク質の立体構造を変化させ、タンパク質機能に影響を与えることが示唆されている（非特許文献１－３）。従って、アミノ酸異性体を含むタンパク質の蓄積は、種々の疾患の発症に関連していると考えられる。
【０００４】
特に、アスパラギン酸（Ａｓｐ）残基は、タンパク質を構成するアミノ酸の中で最も異性化しやすいアミノ酸である。非特許文献４は、合成ペプチドを用いて各Ａｓｐ異性体への異性化速度を計算し、ライフスパンの間のＡｓｐ異性体の蓄積をシミュレートしたものを記載している。タンパク質代謝がなければ、Ｌα－Ａｓｐは数年で急速にＬβ－Ａｓｐに置き換わり、その後Ｄα－ＡｓｐとＤβ－Ａｓｐに徐々に置き換わることが報告されている（非特許文献２）。この結果は、Ｌβ－Ａｓｐの大規模同定のための技術がＡｓｐ異性化タンパク質の包括的探索において非常に重要であることを示す。
【０００５】
Ａｓｐは、特有の異性化機構を有しており、生体の温和な条件下で異性化が進行し、通常のＬα体からＬβ、Ｄα、Ｄβの３つの異性体ヘと異性化する。Ａｓｐは、以下の式１に示すように、スクシンイミドによって媒介される化学平衡反応のために、Ａｓｐ残基のα水素を直接引抜くことなく異性化される。
【０００６】
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【０００７】
Ａｓｐの異性化は化学平衡反応により生じることから、生体内における異性化の主たる要因は時間であると考えられている。したがって、Ａｓｐ残基の異性化は、水晶体や骨などの代謝回転の遅い組織中のタンパク質で起こると考えられている。特に水晶体では、胎児期に形成されたタンパク質が生涯代謝されないため、異性化タンパク質が蓄積している。さらに、白内障患者の水晶体タンパク質のＡｓｐ異性化率は同年齢の健常者よりも高く、Ａｓｐ異性化は白内障発症の引き金であると考えられている（非特許文献５）。このように、Ａｓｐの異性化は、これまでターンオーバーの長い限られた組織においてのみ蓄積・検出できるものと考えらえてきた。しかしながら、近年、血清中のＩｇＧなどにおいても、Ａｓｐ異性体の存在が確認されており、Ａｓｐ異性体が生体内に広く存在する可能性が示唆されている（非特許文献１）。
【０００８】
また、タンパク質中およびペプチド中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基は脱アミド化して、アスパラギン酸残基と同一の構造であるＬ－スクシンイミド体を形成し、アスパラギン酸残基へと変換される。すなわち、アスパラギン酸異性体はＡｓｐ残基およびＡｓｎ残基から形成される。
【０００９】
質量分析によるプロテオミクスは、タンパク質に起こる翻訳後修飾の大規模な探索に有用である。しかしながら、Ａｓｐ異性化は、分子量の変化を伴わないので、リン酸化やグリコシル化のようにプロテオミクスへ適用させることは難しい。
【００１０】
本発明者らは以前、ＬＣクロマトグラムにおいて、Ａｓｐ異性体を有するペプチドが異なる溶出時間で溶出するという特徴に基づいて、Ａｓｐ異性体ペプチドを同定する方法を報告した（非特許文献６、７）。これは、溶出時間を合成ペプチドと一致させるか、あるいは、Ａｓｐ異性体を特異的に切断または変換する酵素を用いることによって達成することができる。具体的には、Ｌα－Ａｓｐは、エンドペプチダーゼ「ＡｓｐＮ」によって切断し、Ｌβ－Ａｓｐには、プロテインＤ－アスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎＤ－ａｓｐａｒｔａｔｅｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＰＩＭＴ）を作用させ、そして、Ｄα－Ａｓｐには、Ｄ－アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（ＤＡＥＰ）で分解する、というものである。しかし、この方法では分析されるペプチドを１つずつ選択する必要があり、Ａｓｐ異性体ペプチドを大規模に探索することは困難である。
（【００１１】以降は省略されています）

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