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公開番号2024105603
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-08-06
出願番号2024080118,2022015802
出願日2024-05-16,2020-02-04
発明の名称CARライブラリおよびscFvの製造方法
出願人国立大学法人愛媛大学
代理人弁理士法人レクシード・テック
主分類C40B 40/08 20060101AFI20240730BHJP(コンビナトリアル技術)
要約【課題】CAR-T細胞において機能しうるscFvのスクリーニングに用いるCARライブラリ、およびそれを用いたscFvの製造方法を提供する。
【解決手段】本発明のキメラ抗原受容体(CAR)ライブラリは、第1のCARをコードする核酸を含み、前記第1のCARは、第1の抗原結合ドメインと、第1の膜貫通ドメインと、第1の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、前記第1の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングする第1の一本鎖抗体(scFv)を含み、前記第1のscFvは、第1の重鎖可変領域と、第1の軽鎖可変領域とを含み、前記第1の重鎖可変領域および前記第1の軽鎖可変領域は、所定の条件を満たす。
【選択図】図44
特許請求の範囲【請求項１】
第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含み、
前記第１のＣＡＲは、第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第１の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングする第１の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、
前記第１のｓｃＦｖは、第１の重鎖可変領域と、第１の軽鎖可変領域とを含み、
前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、下記条件１または条件２を満たす、ＣＡＲライブラリ；
条件１：
前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
条件２：
前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
続きを表示（約 1,700 文字）【請求項２】
前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１記載のＣＡＲライブラリ。
【請求項３】
前記第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む、請求項１または２記載のＣＡＲライブラリ。
【請求項４】
前記第１のＢ細胞受容体は、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体である、請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＡＲライブラリ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＣＡＲライブラリを免疫細胞に発現させる第１の発現工程と、
前記第１の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第１の接触工程と、
前記第１の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するＣＡＲの第１のｓｃＦｖを、前記標的抗原に結合する第１の候補ｓｃＦｖとして選抜する第１の選抜工程とを含む、ｓｃＦｖの製造方法。
【請求項６】
前記第１の候補ｓｃＦｖに基づき、第２のＣＡＲライブラリを調製する調製工程を含み、
前記第２のＣＡＲライブラリは、第２のＣＡＲをコードする核酸を含み、
前記第２のＣＡＲは、第２の抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第２の抗原結合ドメインは、前記標的抗原への結合をスクリーニングする第２のｓｃＦｖを含み、
前記第２のｓｃＦｖは、第２の重鎖可変領域と、第２の軽鎖可変領域とを含み、
前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、下記条件３または条件４を満たし、
さらに、前記第２のＣＡＲライブラリを免疫細胞に発現させる第２の発現工程と、
前記第２の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第２の接触工程と、
前記第２の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するＣＡＲの第２のｓｃＦｖを、前記標的抗原に結合する第２の候補ｓｃＦｖとして第２の選抜工程とを含む、請求項５記載の製造方法；
条件３：
前記第１の発現工程におけるＣＡＲライブラリが前記条件１を満たす場合、
前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
条件４：
前記第１の発現工程におけるＣＡＲライブラリが前記条件２を満たす場合、
前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
【請求項７】
前記第２の接触工程を複数回実施する、請求項６記載のｓｃＦｖの製造方法。
【請求項８】
前記第２の選抜工程において、前記標的抗原のモノマーまたはマルチマーを用いて、前記標的抗原に結合する免疫細胞を検出し、
検出された免疫細胞に発現するｓｃＦｖを、前記第２の候補ｓｃＦｖとして選抜する、請求項６または７記載のｓｃＦｖの製造方法。
【請求項９】
前記第２のＢ細胞受容体は、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体である、請求項６から８のいずれか一項に記載のｓｃＦｖの製造方法。
【請求項１０】
前記第１の接触工程を複数回実施する、請求項５から９のいずれか一項に記載のｓｃＦｖの製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＡＲライブラリおよびｓｃＦｖの製造方法に関する。
続きを表示（約 4,300 文字）【背景技術】
【０００２】
がん特異的抗原または標的抗原に結合する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ：single chain Fv）を発現するＴ細胞（キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞）を用いた、がんの治療が試みられている。
【０００３】
ｓｃＦｖのスクリーニングは、生体から単離されたＢ細胞を用いたハイブリドーマを用いた方法、またはファージディスプレイ法により実施される。具体的に、前者は、抗原免疫後に、生体から単離したＢ細胞を用いてハイブリドーマのライブラリを作成する。そして、標的抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、前記ハイブリドーマが産生する抗体の抗原認識部位の配列を決定することにより実施される。
【０００４】
また、後者は、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含むｓｃＦｖのライブラリを作成後、各ｓｃＦｖをファージに発現させる。そして、標的抗原に結合するファージを選抜し、前記ファージにおけるポリヌクレオチドを同定することにより実施される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、いずれの方法も標的抗原に結合するｓｃＦｖを選抜できるが、ＣＡＲ－Ｔ細胞において機能するｓｃＦｖかは不明である。このため、前記選抜後、標的抗原結合性のｓｃＦｖをそれぞれＴ細胞に発現させ、機能するかを検討する必要がある。
【０００６】
そこで、本発明は、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞において機能しうるｓｃＦｖのスクリーニングに用いるＣＡＲライブラリ、およびそれを用いたｓｃＦｖの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するため、本発明のキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)ライブラリは、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含み、
前記第１のＣＡＲは、第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第１の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングする第１の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、
前記第１のｓｃＦｖは、第１の重鎖可変領域と、第１の軽鎖可変領域とを含み、
前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、下記条件１または条件２を満たす；
条件１：
前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
条件２：
前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
【０００８】
本発明のｓｃＦｖの製造方法（以下、「第１のスクリーニング方法」ともいう）は、前記本発明のＣＡＲライブラリを免疫細胞に発現させる第１の発現工程と、
前記第１の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第１の接触工程と、
前記第１の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するＣＡＲの第１のｓｃＦｖを、前記標的抗原に結合する第１の候補ｓｃＦｖとして選抜する第１の選抜工程とを含む。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞において機能しうるｓｃＦｖのスクリーニングに用いるＣＡＲライブラリ、およびそれを用いたｓｃＦｖの製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図１は、実施例１におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図２は、実施例１におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図３は、実施例１におけるA2/NY-ESO-1
157
テトラマー陽性細胞の割合を示すグラフである。
図４は、実施例１におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。
図５は、実施例１におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。
図６は、実施例１におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図７Ａは、実施例１におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図７Ｂは、実施例１におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図８は、実施例２におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図９は、実施例２におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図１０は、実施例２におけるA2/NY-ESO-1
157
テトラマー陽性細胞の割合を示すグラフである。
図１１は、実施例２におけるペプチド濃度が１０μｇ／ｍＬの場合におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。
図１２は、実施例２におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。
図１３は、実施例３におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図１４は、実施例４におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図１５は、実施例４におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。
図１６は、実施例５におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、3M4E5LH CARを発現するＴ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、L1-3M4E5H CARを発現するＴ細胞の結果を示す。
図１７は、実施例６におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図１８は、実施例６におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。
図１９は、実施例６におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。
図２０は、実施例７におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、3M4E5LH CARを発現するＴ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、3M4E5H-L1 CARを発現するＴ細胞の結果を示す。
図２１は、実施例７におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果Cを示す。
図２２は、実施例８におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図２３は、実施例８におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。
図２４は、実施例８におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。
図２５は、実施例９におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図２６は、実施例９におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。
図２７は、実施例１０におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図２８は、実施例１０におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図２９は、実施例１０におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。
図３０は、実施例１０におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。
図３１は、実施例１０におけるＣＤ１９ダイマー陽性細胞の相対割合を示すグラフである。
図３２は、実施例１０における標的細胞量を変化させた際のＣＤ６９発現量の相対値を示すグラフである。
図３３は、実施例１０におけるサイトカイン産生細胞の割合を示すグラフである。
図３４は、実施例１１における生体における抗腫瘍活性に関する図である。
図３５は、実施例１２における構造的親和性の指標値と、機能的親和性の指標値との関係性を示すグラフである。
図３６は、実施例１３における細胞傷害性を示すグラフであるである。
図３７は、実施例１４における生体における全生存率に関する図である。
図３８は、実施例１４における生体における全生存率に関する図である。
図３９は、実施例１５における細胞の増殖比を示すグラフである。
図４０は、実施例１５におけるサイトカイン産生細胞の割合を示すグラフである。
図４１は、実施例１５における細胞傷害活性を示すグラフである。
図４２は、実施例１５における共培養前後のＣＤ８陽性ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＤ４陽性ＣＡＲ－Ｔ細胞中のＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の分布を示すドットプロットである。
図４３は、実施例１５における各ＣＡＲ－Ｔ細胞の分裂割合と、共培養前後のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性ＣＣＲ７陽性細胞の割合と、ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ６２Ｌ陽性ＣＣＲ７陽性と、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陰性ＰＤ１陽性細胞の割合とを示すグラフである。
図４４は、実施例１５における本発明のスクリーニング方法により、
ｉｎ
ｖｉｖｏ
での抗腫瘍効果に優れるｓｃＦｖを取得できるメカニズムを説明する図である。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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