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公開番号2024156876
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-06
出願番号2024127839,2022177448
出願日2024-08-02,2018-02-13
発明の名称核酸ライブラリーの調製方法ならびにその方法を行うための組成物及びキット
出願人タカラバイオユーエスエー, インコーポレイテッド
代理人個人,個人
主分類C40B 40/08 20060101AFI20241029BHJP(コンビナトリアル技術)
要約【課題】免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを含む核酸ライブラリーの調製方法を提供する。
【解決手段】方法の態様は、RNA試料を伴うテンプレートスイッチング反応を通じて作製した二本鎖相補的DNA(cDNA)から、例えば発現ライブラリー及び/または免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを含む1つ以上のライブラリーを作製することを含む。いくつかの態様では、この方法は、単一細胞からライブラリーを調製したり、及び/または単一細胞レベルでインデックスを付加したライブラリーを調製したりすることを含む。この方法を行う際に用いる組成物及びキットも提供する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
５’増幅プライマーと、
免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーと、
末端増幅プライマーと
を含む、キット。
続きを表示（約 830 文字）【請求項２】
５’アダプター配列及び単一細胞を特定するインデックス付与配列を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
タグメンテーション反応を行うための１つ以上の成分をさらに含み、
前記１つ以上の成分は、
タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインを含むトランスポゾン核酸、
タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインにハイブリダイズするタグメンテーション後増幅プライマー、
トランスポザーゼ、または
これらを組み合わせたもの
を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
５’アダプター配列及び単一細胞を特定するインデックス付与配列を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドと、
前記５’アダプター配列を含む５’増幅プライマーと、
免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーと
を含む、キット。
【請求項５】
前記５’増幅プライマー及び末端増幅プライマーそれぞれは、１つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、請求項１または４に記載のキット。
【請求項６】
免疫細胞レセプターは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）である、請求項１または４に記載のキット。
【請求項７】
ポリ（ｄＴ）プライマーをさらに含む、請求項１または４に記載のキット。
【請求項８】
少なくとも１つのポリメラーゼをさらに含む、請求項１または４に記載のキット。
【請求項９】
前記少なくとも１つのポリメラーゼは、逆転写酵素である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ｄＮＴＰをさらに含む、請求項１または４に記載のキット。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【背景技術】
【０００１】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術の開発によって、有益なゲノム情報及びトランスクリプトーム情報を、作製した核酸ライブラリーから迅速に抽出可能になっている。ハイスループットなＮＧＳ技術（ｌｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シークエンシング、Ｒｏｃｈｅ４５４シークエンシング、Ｉｏｎｔｏｒｒｅｎｔ（Ｐｒｏｔｏｎ／ＰＧＭシークエンシング）及びＳＯＬｉＤシークエンシングなど）によって、それまで使われてきたサンガーシークエンシングよりも迅速かつ安価に核酸分子をシークエンシング可能になるので、これらの技術は、バイオテクノロジーと生物医学的な研究とに大変革をもたらしている。
続きを表示（約 5,200 文字）【０００２】
これらの強力なシークエンシング技術では、ライブラリーの調製が特に重視される。様々な目的で、ＮＧＳ技術を用いて、良好に調製した逆転写相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーを解析できる。例えば、ライブラリーの調製手法に応じて、トランスクリプトームデータを利用して、特定の状況でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子を特定するための発現差解析を行うことができる。
【０００３】
ｃＤＮＡライブラリーは、ＮＧＳによるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）プロファイリングにも用いることができる。ＴＣＲは、Ｔ細胞のセレクション、機能及び活性化を制御するとともに、そのＴ細胞が、どの抗原ペプチド－主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の複合体に応答するかを判断する。
【０００４】
各細胞においては、ＴＣＲ遺伝子の可変部セグメント、多様性セグメント及び結合セグメント（Ｖ（Ｄ）Ｊ）の体細胞組み換えから、ＴＣＲのα鎖遺伝子とβ鎖遺伝子とが導き出されるので、個体のＴＣＲレパートリーは、非常に多様性が高い。ＴＣＲのこの多様性をプロファイリングすると、免疫レパートリーダイナミクスに対する理解が促進され、免疫応答の性質と免疫障害の病態との知識が深まる。上記のような知見により、急速に進歩しているイムノオンコロジー分野を含む様々な療法が進化する。
【発明の概要】
【０００５】
核酸ライブラリーの調製方法を提供する。この方法の態様は、ＲＮＡ試料を伴うテンプレートスイッチング反応を通じて作製した二本鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から、例えば発現ライブラリー及び／または免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを含む１つ以上のライブラリーを作製することを含む。いくつかの態様では、この方法は、単一細胞からライブラリーを調製したり、及び／または単一細胞レベルでインデックスを付加したライブラリーを調製したりすることを含む。この方法を行う際に用いる組成物及びキットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
本開示の実施形態に従って、単一のＲＮＡ試料から２つの核酸ライブラリーを調製する方法の概略図を示している。
本開示の実施形態に従って、単一のＲＮＡ試料から発現ライブラリーと免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとを調製する方法の概略図を示している。
テンプレートスイッチング反応を用いて、産物二本鎖核酸を作製する概略図を示している。
ライブラリーの調製法でタグメンテーションを使用する例であって、本開示の方法での使用に適合できる例を示している。
本開示の実施形態に従って、遺伝子発現差解析とＴＣＲプロファイリングとを複合する際に用いるライブラリーを作製する際に用いるプロセス全体を示す全体概略図を示している。
本明細書に示されている関連実施例で説明されているように、単一Ｔ細胞からＴＣＲプロファイリング用ライブラリーを調製する際に用いるプロセス全体を示す全体概略図を示している。
図６に示されている実施例に関連するように、９６ウェルプレートにおけるインデックス付与オリゴの分布と試料のプールとを図示している。
免疫細胞プロファイリングワークフローの性能を試験したデータを示しており、単一のＪｕｒｋａｔ細胞または単一細胞当量のＪｕｒｋａｔＲＮＡのいずれかから作製したシークエンシングリードのうち、ＴＣＲ－α ＣＲＤ３領域またはＴＣＲ－β ＣＤＲ３領域にマッピングされたシークエンシングリードの割合（％）を示している。
免疫細胞プロファイリングワークフローの性能を試験したさらなるデータを示しており、予想されるＪｕｒｋａｔクロノタイプにマッピングされたシークエンシングリードの割合（％）を示している。
マルチサンプルナノディスペンサー（ＭＳＮＤ）形態で試験した単一細胞ＴＣＲプロファイリングワークフローの全体概略図を示している。
単一のＪｕｒｋａｔ細胞由来のシークエンシングリードであって、ＴＣＲ－αまたはＴＣＲ－βのＣＤＲ３領域にマッピングされたシークエンシングリードのアラインメント解析の結果を示している。
本発明の実施形態に従って、マルチサンプルナノディスペンサー（ＭＳＮＤ）形態で試験した単一細胞ＴＣＲプロファイリングワークフローの全体的な詳細を示している。
本発明の実施形態に従って、マルチサンプルナノディスペンサー（ＭＳＮＤ）形態で試験した単一細胞ＴＣＲプロファイリングワークフローの全体的な詳細を示している。
本発明の実施形態に従って、マルチサンプルナノディスペンサー（ＭＳＮＤ）形態で試験した単一細胞ＴＣＲプロファイリングワークフローの全体的な詳細を示している。
本発明の実施形態に従って、マルチサンプルナノディスペンサー（ＭＳＮＤ）形態で試験した単一細胞ＴＣＲプロファイリングワークフローの全体的な詳細を示している。
下記の実験部分に説明されているように、図１２Ａ～１２Ｄのプロトコールを用いて作製した免疫細胞レセプターシークエンシングライブラリー由来のαレセプターリードカウントとβレセプターリードカウントとを示している。
下記の実験部分に説明されているように、図１２Ａ～１２Ｄのプロトコールを用いて作製した分割ＷＴＡライブラリー由来の例示的なデータを示している。遺伝子本体のカバレッジデータを示しており、Ｘ軸は、全遺伝子にわたる正規化カバレッジであり、Ｙ軸は、マッピングされた全エキソンリードである。図には、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞の一例が示されている。
下記の実験部分に説明されているように、図１２Ａ～１２Ｄのプロトコールを用いて作製した分割ＷＴＡライブラリー由来の例示的なデータを示している。主要成分解析を示しており、図１３に示されているように、ＴＡＬＬ、ＣＣＲＦ及び処理（ＰＭＡ）ＣＣＲＦ細胞由来の５’ＤＥライブラリーからマッピングされたリードである（矢印は、別々の群を示している）。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション条件」という用語は、プライマーまたはその他のポリヌクレオチドが、標的核酸の領域のうち、そのプライマーまたはその他のポリヌクレオチドとある程度の相補性を有する領域に特異的にハイブリダイズする条
件を意味する。プライマーが標的核酸に特異的にハイブリダイズするか否かは、そのポリマーと標的核酸との相補性の程度、ハイブリダイゼーションが行われる温度（そのプライマーの融解温度（ＴＭ）によって明らかにできる）などの因子によって決まる。融解温度とは、プライマーと標的核酸との二本鎖の半数がハイブリダイズしたままであり、その二本鎖の半数が一本鎖に解離する温度を指す。二本鎖のＴｍは、実験によって求めても、Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ含量）－（６０／Ｎ）という式（式中、Ｎは鎖長であり、［Ｎａ＋］は１Ｍ未満である）を用いて予測してもよい。ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ（２００１；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＮ．Ｙ．，Ｃｈ．１０）を参照されたい。様々なパラメーターに左右される、さらに進化した他のモデルを用いて、様々なハイブリダイゼーション条件に応じた、プライマー／標的二本鎖のＴｍを予測してもよい。特異的核酸ハイブリダイゼーションを行うためのアプローチは、例えばＴｉｊｓｓｅｎ，ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎ
ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ－ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔＩ，ｃｈａｐｔｅｒ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄｐｒｏｂｅａｓｓａｙｓ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９３）に見ることができる。
【０００８】
「相補的な」及び「相補性」という用語は、本明細書で使用する場合、標的核酸の全体または領域（例えば、産物核酸の領域）への非共有結合によって塩基対形成するヌクレオチド配列を指す。カノニカルなワトソン・クリック塩基対形成では、ＤＮＡにおいて、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と塩基対を形成し、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と塩基対を形成する。ＲＮＡでは、チミンは、ウラシル（Ｕ）に置き換えられる。したがって、Ａは、Ｔと相補的であり、Ｇは、Ｃと相補的である。ＲＮＡでは、Ａは、Ｕと相補的であり、Ｕは、Ａと相補的である。典型的には、「相補的な」とは、少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を指す。「相補的」という用語には、一方の鎖のすべてのヌクレオチドが、対応する位置において、もう一方の鎖のすべてのヌクレオチドと相補的であるように、完全に相補的である二本鎖も含まれる。特定のケースでは、ヌクレオチド配列は、標的と部分的に相補的であってよく、この場合、すべてのヌクレオチドが、すべての対応する位置において、標的核酸のすべてのヌクレオチドと相補的であるわけではない。例えば、プライマーは、標的核酸と完全に（すなわち１００％）相補的であってもよく、あるいは、プライマーと標的核酸は、完全ではない、ある程度の相補性（例えば、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％）を有してよい。
【０００９】
２つのヌクレオチド配列の同一性（％）は、最適に比較する目的でそれらの配列をアラインメントすることによって求めることができる（例えば、最適なアラインメントのために、第１の配列の配列にギャップを導入することができる）。そして、対応する位置のヌクレオチドを比較するのだが、２つの配列の同一性（％）は、それらの配列が共有している同一の位置の数から導き出す（すなわち、同一性（％）＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。一方の配列のある位置が、もう一方の配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占められているときには、その分子は、その位置において同一である。このような数学的なアルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－５８７７（１９９３）に記載されている。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３８９－３４０２（１９９７）に記載されているように、ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴのプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴとのプログラムを用いるときには、各プロ
グラム（例えばＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。一態様では、配列比較のためのパラメーターは、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定することができ、あるいは、変更することができる（例えば、ワード長＝５またはワード長＝２０）。
【００１０】
ドメインとは、複数のヌクレオチドで構成されている、核酸の伸長部分または長さ部分であって、明確な機能をその核酸に付与する伸長部分または長さ部分を指す。ドメインの例としては、バーコード付きユニークモレキュラーアイデンティファイアー（ＢＵＭＩ）ドメイン、プライマー結合ドメイン、ハイブリダイゼーションドメイン、バーコードドメイン（ソースバーコードドメインなど）、ユニークモレキュラーアイデンティファイアー（ＵＭＩ）ドメイン、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）アダプタードメイン、ＮＧＳインデックス付与ドメインなどが挙げられる。いくつかのケースでは、「ドメイン」及び「領域」という用語は、同義的に用いられている場合があり、例えば、免疫レセプター鎖のドメイン／領域（例えば、免疫レセプター定常ドメイン／定常領域など）を説明している場合が挙げられる。ある所定のドメインの長さは、様々であってよいが、いくつかのケースでは、その長さは、２～１００ｎｔ（５～５０ｎｔなど）、例えば５～３０ｎｔの範囲である。
（【００１１】以降は省略されています）

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