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公開番号2024161413
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-19
出願番号2024125563,2020567787
出願日2024-08-01,2019-06-05
発明の名称核酸ライブラリを生成する方法ならびにそれを実施するための組成物およびキット
出願人ザリージェンツオブザユニバーシティオブカリフォルニア,The Regents of the University of California
代理人個人,個人,個人
主分類C40B 40/06 20060101AFI20241112BHJP(コンビナトリアル技術)
要約【課題】核酸ライブラリを生成するための組成物を提供する。
【解決手段】一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸(SSB結合ssNA)、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプリントオリゴヌクレオチドを組み合わせて、SSB結合ssNAの末端領域とアダプターオリゴヌクレオチドとにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を含む組成物であって、複合体は、SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域を介してSSB結合ssNAの末端領域にハイブリダイズした第1のスプリントオリゴヌクレオチドを含み、かつ第1のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して第1のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした第1のスプリントオリゴヌクレオチドを含み、これにより第1のアダプターオリゴヌクレオチドの末端がSSB結合ssNAの前記末端領域の末端に隣接する組成物が提供される。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
核酸ライブラリを生成する方法であって、
一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と接触させて、ＳＳＢ
結合ｓｓＮＡを生成することと、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ、
第１のアダプターオリゴヌクレオチド、ならびに
ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のアダプターオリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第１のスプリントオリゴヌクレオチド
を組み合わせることと、
を含み、
前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を介して前記ＳＳＢ結合ｓｓＮ
Ａの末端領域にハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記
第１のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第１のア
ダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第１のスプリントオリゴヌクレ
オチドを含む複合体を形成し、これにより、前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドの
末端が前記ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記末端領域の末端に隣接する、方法。
続きを表示（約 660 文字）【請求項２】
前記第１のアダプターオリゴヌクレオチドおよびＳＳＢ結合ｓｓＮＡの前記隣接する末
端を共有結合させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触、組み合わせること、および共有結合のステップの合計持続時間が、３時間以
下である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複合体が、前記ＳＳＢと接触された前記ｓｓＮＡの８０％以上から形成される、請
求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｓｓＮＡが、分解された核酸試料からのものである、請求項１～４のいずれか一項
に記載の方法。
【請求項６】
前記ｓｓＮＡが、古代核酸試料からのものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｓｓＮＡが、法医学核酸試料からのものである、請求項１～６のいずれか一項に記
載の方法。
【請求項８】
前記ｓｓＮＡが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である、請求項１～７のいずれか一項に
記載の方法。
【請求項９】
前記ｓｓＤＮＡは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するものである、請求項８に記載
の方法。
【請求項１０】
前記ｓｓＤＮＡをＳＳＢと接触させる前に、前記ｄｓＤＮＡを変性させることによって
前記ｓｓＤＮＡを生成することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月６日に出願された米国仮特許出願第６２／６８１，５２４号
の利益を主張し、その出願はその全体において参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 3,100 文字）【背景技術】
【０００２】
核酸配列決定は、診断および他の用途での使用により、ますます重要な遺伝子研究の分
野となっている。一般に、核酸配列決定は、ＲＮＡまたはＤＮＡの断片などの核酸のヌク
レオチドの順序を決定することからなる。相対的に短い配列が典型的に分析され、得られ
た配列情報は、断片が誘導されたはるかにより広範な長さの遺伝子材料の配列を確実に決
定するために、断片を参照配列に対して整列させるか、または断片を論理的に一緒に適合
させるために、様々なバイオインフォマティクス方法において使用され得る。特徴的断片
の自動コンピュータベースの検査が開発され、ゲノムマッピング、個体間の遺伝的変異の
分析、遺伝子およびそれらの機能の識別などに最近より使用されている。
【０００３】
高スループットＤＮＡ配列決定に用いられるいくつかの方法は、ユニバーサル増幅反応
に依存し、それによって、ＤＮＡ試料はランダムに断片化され、次いで、異なる断片の末
端がすべて同じＤＮＡ配列を含むように処理される。ユニバーサル末端を有する断片は、
単一の増幅プライマー対を有する単一の反応において増幅され得る。ＰＣＲによって増幅
される標的の末端へのユニバーサルプライミング配列の付加は、様々な方法によって達成
され得る。例えば、その５’末端にユニバーサル配列およびその３’末端に縮重配列を有
するユニバーサルプライマーを使用して、複雑な標的配列または標的配列の複雑な混合物
からランダムに断片を増幅することができる。プライマーの３’縮重部分は、ＤＮＡ上の
ランダムな位置でアニーリングし、伸長して、その５’末端にユニバーサル配列を有する
標的のコピーを生成することができる。
【０００４】
あるいは、ユニバーサルプライミング配列を含むアダプターを標的配列の末端にライゲ
ーションすることができる。１つ以上のアダプターが、標的配列とのライゲーション反応
において使用され得る。ユニバーサル増幅のための１つ以上のアダプター配列のライゲー
ションを介して核酸配列決定ライブラリを調製するための現在の方法に関連する欠点は、
かかる方法によって必要とされる時間および費用である。
【発明の概要】
【０００５】
核酸ライブラリを生成する方法が提供される。方法は、一本鎖核酸結合タンパク質に結
合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプ
リント（splint：添え木）オリゴヌクレオチドを組み合わせて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末
端領域とアダプターオリゴヌクレオチドとにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌク
レオチドを含む複合体を形成することを含む。第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末
端（ｅｎｄ）は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの第１の末端領域（ｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｇｉｏ
ｎ）の末端に隣接しており、方法は、隣接する末端を共有結合させることをさらに含み得
る。例えば本開示の方法の実施において用途を見出す、組成物およびキットも提供される
。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
本開示の一実施形態による核酸ライブラリを生成する方法の概略図。
分解ＤＮＡ（上部パネル）および現代ＤＮＡ（下部パネル）についての、他の方法と本開示の例示的な方法の比較。
毛髪ＤＮＡ長さ分布。左のパネルは、現代の毛髪ＤＮＡからＳａｎｔａＣｒｕｚ法（ＳＲＬ３）によって生成されたテンプレート分子の観察された長さを示す。毛髪軸中のＤＮＡについて予想されるように、インタクトな分子の長さは概して短い。同様の長さ分布が右パネルに示される（ＳＲＬ４）。
ＳＲＬ３およびＳＲＬ４における推定ライブラリ複雑度（固有の分子の数）。
ライブラリの複雑度比較。配列決定ライブラリは、本開示の例示的な方法、ＳＳ２．０、ＢＥＳＴ、およびフォーク型アダプターライゲーションを使用して作製した。ライブラリの複雑度（ライブラリ中の固有の分子の数）は、３つ組の実験において、Ｐｒｅｓｅｑ（左）を用いて、またはｑＰＣＲ（右）を介して、数百万のリードから推定した。本開示の例示的な方法は、次の最良のプロトコルであるＳＳ２．０よりも２～３倍多くの抽出ＤＮＡを配列決定ライブラリに変換する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
核酸ライブラリを生成する方法が提供される。方法は、一本鎖核酸結合タンパク質に結
合した一本鎖核酸（ＳＳＢ結合ｓｓＮＡ）、アダプターオリゴヌクレオチド、およびスプ
リントオリゴヌクレオチドを組み合わせて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡの末端領域とアダプター
オリゴヌクレオチドとにハイブリダイズされたスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合
体を形成することを含む。第１のアダプターオリゴヌクレオチドの末端は、ＳＳＢ結合ｓ
ｓＮＡの第１の末端領域の末端に隣接しており、方法は、隣接する末端を共有結合させる
ことをさらに含み得る。例えば本開示の方法の実施において用途を見出す、組成物および
キットも提供される。
【０００８】
本開示の方法、組成物、およびキットをより詳細に記載する前に、当該方法、組成物、
およびキットは、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら変更され得
ることが理解されるべきである。当該方法、組成物、およびキットの範囲は添付の特許請
求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を
説明する目的のためのものに過ぎず、限定的であることは意図していないこともまた理解
されたい。
【０００９】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈上他に明確な指示の
ない限り下限の単位の１０分の１までの、各介在値、およびいずれかの他の記載された値
またはその記載された範囲内の介在値が、方法、組成物、およびキットに包含されること
を理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲
に含まれ得、記載された範囲内のいずれかの特に除外された限界を除き、それらも方法、
組成物、およびキット内に包含される。記載された範囲が一方または両方の限界を含む場
合、それらの含まれる限界のうちの一方または両方を除外する範囲もまた、方法、組成物
、およびキットに含まれる。
【００１０】
特定の範囲は、数値の前に「約」という用語が付されて本明細書で提示される。本明細
書に使用される「約」という用語は、それが先行する正確な数、ならびにその用語が先行
する数に近いかまたはほぼ等しい数のための文言的サポートを提供する。ある数が特定の
明記された数に近いかあるいはほぼ等しいかを決定するにあたり、近いかあるいはほぼ等
しいが明記はされていない数は、それが提示されている文脈において具体的に明記された
数と実質的に等価な数であり得る。
（【００１１】以降は省略されています）

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