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公開番号2024178329
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-12-24
出願番号2024164079,2022096601
出願日2024-09-20,2018-11-05
発明の名称核酸インデックス付け技術
出願人イルミナインコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人
主分類C40B 40/06 20060101AFI20241217BHJP(コンビナトリアル技術)
要約【課題】本発明が解決しようとする課題は、帰属エラーが低減した複数試料調製物におけるハイスループットシークエンシングを可能とする方法を開発することである。
【解決手段】本発明は、シークエンシングと組み合わせて使用するための、核酸のインデックス付けのための技術に関する。該技術は、個々の試料からインデックス付き核酸断片を生成することを含み、それにより、核酸断片の各インデックス部位に組み込まれたインデックス配列は、複数の区別可能なインデックス配列から選択され、生成された核酸断片の集団は、複数のインデックス配列からの各インデックス配列を提示する。このようにして、単一の試料から生成されたインデックス付き核酸断片は、低い配列多様性と関連付けられるインデックスリードエラーに起因する割当ての誤りを低減させるインデックス配列の多様な混合物を用いてインデックス付けされる。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
試料インデックス付き核酸ライブラリー調製物であって、
第1の試料から調製された第1の核酸ライブラリーであって、前記第1の核酸ライブラリーが第1の複数の核酸断片を含み、前記第1の複数の核酸断片のそれぞれが、インデックス配列の第1のセットから選択される少なくとも2つの異なるインデックス配列を含む、前記第1の核酸ライブラリー;
第2の試料から調製された第2の核酸ライブラリーであって、前記第2の核酸ライブラリーが第2の複数の核酸断片を含み、前記第2の複数の核酸断片のそれぞれが、インデックス配列の前記第1のセットと区別可能なインデックス配列の第2のセットから選択される少なくとも2つの異なるインデックス配列を含む、前記第2の核酸ライブラリー
を含み、
前記インデックス配列の第1のインデックス配列が標的配列の5'に位置し、前記インデックス配列の第2のインデックス配列が前記標的配列の3'に位置するように、前記インデックス配列が、前記第1の複数の核酸断片及び前記第2の複数の核酸断片の個々の核酸断片において配置されている、
ライブラリー調製物。
続きを表示（約 1,700 文字）【請求項２】
(i)前記第1の複数の核酸断片が、前記第1の複数の核酸断片内の他の個々の核酸断片に対して、インデックス配列の前記第1のセットからの2つの異なるインデックス配列の異なる組合せを有する個々の核酸断片を含み、且つ/又は
(ii)前記第2の複数の核酸断片が、前記第2の複数の核酸断片内の他の個々の核酸断片に対して、インデックス配列の前記第2のセットからの2つの異なるインデックス配列の異なる組合せを有する個々の核酸断片を含む、請求項1に記載のライブラリー調製物。
【請求項３】
インデックス配列の前記第1のセットの各インデックス配列が、前記第1の複数の核酸断片中に、インデックス配列の前記第1のセット中の他のインデックス配列に対して0.9～1.1の間の比で存在し、任意選択的に、インデックス配列の前記第1のセットの各インデックス配列が、前記第1の複数の核酸断片中に、おおよそ等しい割合で存在する、請求項1又は請求項2に記載のライブラリー調製物。
【請求項４】
インデックス配列の前記第1のセットからのインデックス配列の部分が、前記第1の複数の核酸断片中の前記標的配列の5'にのみ位置し、前記標的配列の3'には位置しない、請求項1から3のいずれか一項に記載のライブラリー調製物。
【請求項５】
インデックス配列の前記第1のセットからのインデックス配列の別の部分が、前記第1の複数の核酸断片中の前記標的配列の3'にのみ位置し、前記標的配列の5'には位置しない、請求項4に記載のライブラリー調製物。
【請求項６】
インデックス配列の前記第2のセットの各インデックス配列が、前記第2の複数の核酸断片中に、インデックス配列の前記第2のセット中の他のインデックス配列に対して0.9～1.1の間の比で存在し、任意選択的に、インデックス配列の前記第2のセットの各インデックス配列が、前記第2の複数の核酸断片中に、おおよそ等しい割合で存在する、請求項1から5のいずれか一項に記載のライブラリー調製物。
【請求項７】
インデックス配列の前記第2のセットからのインデックス配列の部分が、前記第2の複数の核酸断片中の前記標的配列の5'にのみ位置し、前記標的配列の3'には位置しない、請求項1から6のいずれか一項に記載のライブラリー調製物。
【請求項８】
インデックス配列の前記第2のセットからのインデックス配列の別の部分が、前記第2の複数の核酸断片中の前記標的配列の3'にのみ位置し、前記標的配列の5'には位置しない、請求項7に記載のライブラリー調製物。
【請求項９】
前記第1の試料及び前記第2の試料が異なる個体からの核酸試料である、請求項1から8のいずれか一項に記載のライブラリー調製物。
【請求項１０】
核酸分子をシークエンシングする方法であって、
試料から生成された複数のデュアルインデックス付き核酸断片を用意する工程であって、前記核酸断片の各個々の核酸断片が、5'アダプター配列、5'インデックス配列、3'アダプター配列、及び3'インデックス配列を含み、前記試料と関連付けられる5'インデックス配列の第1のセットから選択される複数の異なる5'インデックス配列及び前記試料と関連付けられる3'インデックス配列の第2のセットから選択される複数の異なる3'インデックス配列が、前記デュアルインデックス付き核酸断片中に提示され、前記複数の異なる5'インデックス配列及び前記複数の異なる3'インデックス配列が互いに区別可能である、前記用意する工程、
前記デュアルインデックス付き核酸断片の配列を表すシークエンシングデータを生成する工程、及び
前記配列のうちの個々の配列が、前記第1のセットから選択される前記5'インデックス配列及び前記第2のセットから選択される前記3'インデックス配列の両方を含む場合にのみ、前記個々の配列を前記試料と関連付ける工程
を含む、方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年11月6日に出願された「NUCLEIC ACID INDEXING TECHNIQUES」というタイトルの米国仮出願第62/582,175号に対する優先権及び利益を主張し、該仮出願の開示は、参照することにより全ての目的のために全体が本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 4,600 文字）【０００２】
本開示は、一般に、配列データのような生物学的試料に関するデータの分野に関する。より具体的には、本開示は、核酸をインデックス付けし、取得された配列データにおいてインデックス付き配列を分解するための技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子シークエンシングは、遺伝学的研究のますます重要な領域となりつつあり、診断及び他の応用における将来の使用が期待されている。一般に、遺伝子シークエンシングは、RNA又はDNAの断片のような核酸についてヌクレオチドの順序を決定することを伴う。次世代シークエンシング技術は、プールされた試料調製物、例えば複数試料調製物を使用することでより高いスループットのシークエンシングを促進する。プールされた試料調製物内において、プールされた試料からの各シークエンシングリードがプール中の個々の試料と関連付けられうるか又は帰属されうるように、各個々の試料はタグ付け又はそれ以外にマークを付されうる。しかしながら、取得された配列データは、例えば、試料の欠陥、試料調製のエラー、及びシークエンシングバイアスといった、様々な原因から導入されるエラー及びノイズを有することがあり、それにより、各個々の試料に関連付けられた配列データの正確性が低下しうる。したがって、帰属エラーが低減した複数試料調製物におけるハイスループットシークエンシングを可能とする方法を開発することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
米国特許出願公開第2007/0166705号明細書
米国特許出願公開第2006/0188901号明細書
米国特許出願公開第2006/0240439号明細書
米国特許出願公開第2006/0281109号明細書
米国特許出願公開第2005/0100900号明細書
米国特許第7,057,026号明細書
WO 05/065814
WO 06/064199;
WO 07/010,251
米国特許第6,969,488号明細書
米国特許第6,172,218号明細書
米国特許第6,306,597号明細書
米国特許第7,001,792号明細書
US 2009/0026082 A1
US 2009/0127589 A1
US 2010/0137143 A1
US 2010/0282617 A1
米国特許第7,329,860号明細書
【非特許文献】
【０００５】
Soni & Meller, Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007)
Healy, Nanomed. 2, 459-481 (2007)
Cockroft ら J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)
Levene ら Science 299, 682-686 (2003)
Lundquist ら Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008)
Korlach ら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、生物学的試料の試料インデックス付けのための新規のアプローチを提供する。本明細書において提供されるように、試料インデックス付けは、取得されたシークエンシングリードが特定の試料と関連付けられるプロセスである。特に、開示されるインデックス付け技術は、試料間の汚染を導入せず、任意に少ない数の試料(陽性試料追跡のために1つまで少なくされる)を用いてロバストに機能し、マルチプレックス試料にわたる提示さえもサポートする。インデックス交差汚染、低プレックスの試料インデックス付け性能、及び変動するインデックス性能の問題は、断片1つ当たりのデュアルインデックス付けを使用して、第1及び第2のインデックスについて複数のインデックスの潜在的なプールを使用して試料から調製された各核酸断片を標識するインデックス付け戦略を用いることで解決される。開示される技術は、伝統的なコンビナトリアルアプローチとは対照的に、第1及び第2の両方のインデックスにおいて各試料に複数のユニークインデックスを割り当てる。一実施形態では、インデックス配列は、試料の同定及び/又は試料の関連付けのために試料からの核酸に組み込まれうる外因性核酸配列である。例えば、本明細書において提供されるインデックス配列は、試料調製の間及び/又はシークエンシングの間に目的の試料に由来する核酸断片に組み込まれうる。各インデックス配列は、シークエンシング反応において使用される他のインデックス配列に対して区別可能な配列を有する。ある特定の実施形態では、インデックス配列は、1つ又は複数の試料の内因性核酸と区別可能である。インデックス配列は、一本鎖又は二本鎖であってよく、少なくとも5塩基、少なくとも6塩基、少なくとも7塩基、少なくとも8塩基、又はより多くでありうる。ある特定の実施形態では、インデックス配列は、5～8塩基、5～10塩基、5～15塩基、5～25塩基、8～10塩基、8～12塩基、8～15塩基、又は8～25塩基等の長さでありうる。
【０００７】
開示される技術は、特定の試料に由来する核酸断片が、各インデックス部位においてインデックス配列の予め設定されたプールを使用してインデックス付けされる、インデックス付けシークエンシングを提供する。ある特定の実施形態は、核酸断片1つ当たり2つの別々のインデックス部位の状況(すなわち、デュアルインデックス付け)において開示されるが、開示される技術は、各核酸断片について、少なくとも1つのインデックス部位、少なくとも2つのインデックス部位を有し、3つ、4つ、又はより多くのインデックス部位を組み込みうる核酸断片を用いて使用されうることが理解されるべきである。本明細書において提供されるインデックス付き試料は、他のインデックス付き試料が各インデックス部位においてインデックス配列の異なるプールを用いてインデックス付けされている限り、シークエンシング用の他のインデックス付き試料と共にプールされうる。したがって、本発明の技術は、プールされた又は複数試料のシークエンシング反応を可能とし、それにより、シークエンシング反応における各個々の試料は、インデックス配列の割り当てられたユニークなセットを用いてインデックス付けされ、取得されるシークエンシングリードは、割り当てられたユニークインデックスを介して、起源となる適切な試料と関連付けられる。
【０００８】
本発明の技術は、試料断片1つ当たり、且つ/又は各インデックス部位にシングルインデックス配列を組み込む技術と比べてシークエンシングの正確性を向上させる。例えば、シークエンシング解析は、例えば、デュアルインデックス付き断片について第1及び第2の両方のインデックス部位において又はシングルインデックス付き断片について1つのみのインデックス部位において、適切な割り当てられたインデックスを含まない任意のシークエンシングリードを破棄する規則に基づく割当てを使用して行われうる。各試料についての選択される割り当てられるインデックスは、多様であり、様々なシークエンシング技術を使用して区別可能であるように設計される。例えば、各インデックス配列は、内部の多様性、その割り当てられたセット内の多様性、及びプール中の他の試料に割り当てられる他のインデックス配列と比べた多様性を有する。このようにして、インデックス中の単一塩基リードにおけるシークエンシングデバイスエラーが起こる可能性はより低くなり、これは、インデックスの多様性がミスリードを低減させるためである。一例では、シークエンシングランが低プレックス又は少数の試料を有する場合、インデックス配列データはそれでもなお、各インデックス部位における異なるインデックス配列の数が試料の数と1:1の対応を有する場合に予想されるよりも高い多様性を反映しうる。すなわち、試料インデックス部位1つ当たりシングルインデックス配列のみを使用し、それにより各試料が各インデックス部位において1つのインデックスとのみ関連付けられて、そのような1:1の対応をもたらすのではなく、各試料は、各インデックス部位において可能性のある複数のインデックス配列と関連付けられる。したがって、異なる又は区別可能なインデックス配列は、各インデックス部位について、いくつもの試料に対して少なくとも2:1、少なくとも3:1、又は少なくとも4:1の比で存在する。一例では、専用のインデックスリードを組み込んだシークエンシング技術(すなわち、インデックス配列の上流のみを標的化するインデックスプライマーを使用して、インデックス配列の長さに対応する限られた塩基数をシークエンシングする)について、本発明の技術及び向上したインデックス多様性は、より正確な塩基コールを結果としてもたらしうる。
【０００９】
インデックス配列データの正確性を増加させることにより、規則に基づく割当てにしたがってより少数のシークエンシングリードが破棄され、それはまた、低濃度試料及び低い試料数の場合にさえシークエンシングの正確性を向上させる。更に、インデックスシークエンシングの向上した正確性を介して向上した試料の関連付けは、インデックスホッピング(すなわち、インデックスの同定誤りを介する試料へのシークエンシングリードの誤った割当て)の効果を低減させる。
【００１０】
一実施形態では、試料インデックス付き核酸ライブラリー調製物であって、第1の試料から調製された第1の核酸ライブラリーであって、第1の核酸ライブラリーが第1の複数の核酸断片を含み、第1の複数の核酸断片のそれぞれが、インデックス配列の第1のセットから選択される少なくとも2つの異なるインデックス配列を含む、第1の核酸ライブラリー;第2の試料から調製された第2の核酸ライブラリーであって、第2の核酸ライブラリーが第2の複数の核酸断片を含み、第2の複数の核酸断片のそれぞれが、インデックス配列の第1のセットと区別可能なインデックス配列の第2のセットから選択される少なくとも2つの異なるインデックス配列を含む、第2の核酸ライブラリーを含み、インデックス配列の第1のインデックス配列が標的配列の5'に位置し、インデックス配列の第2のインデックス配列が標的配列の3'に位置するように、インデックス配列が、第1の複数の核酸断片及び第2の複数の核酸断片の個々の核酸断片において配置されている、ライブラリー調製物が提供される。
（【００１１】以降は省略されています）

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