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公開番号2024160269
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-13
出願番号2024124506,2022129859
出願日2024-07-31,2015-10-16
発明の名称連続性を維持した転位
出願人イルミナケンブリッジリミテッド
代理人個人
主分類C40B 40/06 20060101AFI20241106BHJP(コンビナトリアル技術)
要約【課題】標的核酸のバーコード化DNAフラグメントのライブラリーを調製する方法を提供する。
【解決手段】(a)標的核酸を複数のトランスポソーム複合体と接触させるステップと、(b)前記標的核酸を複数のフラグメントにフラグメント化し、前記フラグメントの少なくとも1つの鎖の5’末端に複数の転移鎖を挿入するステップと、(c)前記標的核酸の複数のフラグメントを複数の固体支持体と接触させるステップであって、前記複数の固体支持体の各々は複数の固定化オリゴヌクレオチドを含み、各オリゴヌクレオチドは相補的な捕捉配列及び第1のバーコード配列を含むステップと、(d)前記バーコード配列の情報を前記標的核酸のフラグメントに転移させ、それにより二本鎖フラグメントのライブラリーを作製するステップと、を含む、標的核酸のバーコード化DNAフラグメントのライブラリーを調製する方法である。
【選択図】図18
特許請求の範囲【請求項１】
（ａ）標的核酸を複数のトランスポソーム複合体と接触させるステップであって、
各トランスポソーム複合体は、トランスポゾン及びトランスポザーゼを含み、
前記トランスポゾンは、転移鎖及び非転移鎖を含み、前記トランスポソーム複合体の
少なくとも１つの前記トランスポゾンは、相補的な捕捉配列にハイブリダイズすることが
可能なアダプター配列を含む、ステップと、
（ｂ）前記標的核酸を複数のフラグメントにフラグメント化し、前記標的核酸の連続性
を維持しながら前記フラグメントの少なくとも１つの鎖の５’末端に複数の転移鎖を挿入
する、ステップと、
（ｃ）前記標的核酸の前記複数のフラグメントを複数の固体支持体と接触させるステッ
プであって、前記複数の固体支持体の各々は複数の固定化オリゴヌクレオチドを含み、各
前記オリゴヌクレオチドは相補的な捕捉配列及び第１のバーコード配列を含み、前記複数
の固体支持体中の各固体支持体からの第１のバーコード配列は、前記複数の固体支持体中
の他の固体支持体からの第１のバーコード配列とは異なる、ステップと、
（ｄ）前記バーコード配列の情報を前記標的核酸のフラグメントに転移させ、それによ
り二本鎖フラグメントのライブラリーを作製するステップであって、少なくとも１つの鎖
が前記第１のバーコードで５’タグ化され、同じ前記標的核酸の少なくとも２つのフラグ
メントが同一のバーコード情報を受け取る、ステップと
を含む、標的核酸のバーコード化ＤＮＡフラグメントのライブラリーを調製する方法。
続きを表示（約 2,300 文字）【請求項２】
（ａ）標的核酸を複数のトランスポソーム複合体と接触させるステップであって、
各トランスポソーム複合体は、トランスポゾン及びトランスポザーゼを含み、
前記トランスポゾンは、転移鎖及び非転移鎖を含み、前記トランスポソーム複合体の
少なくとも１つの前記トランスポゾンは、相補的な捕捉配列にハイブリダイズすることが
可能なアダプター配列を含む、ステップと、
（ｂ）前記標的核酸を複数のフラグメントにフラグメント化し、前記標的核酸の連続性
を維持しながら複数の転移鎖を挿入するステップと、
（ｃ）前記標的核酸の前記複数のフラグメントを複数の固体支持体と接触させるステッ
プであって、前記複数の固体支持体の各々は複数の固定化オリゴヌクレオチドを含み、各
前記オリゴヌクレオチドは相補的な捕捉配列及び第１のバーコード配列を含み、前記複数
の固体支持体中の各固体支持体からの第１のバーコード配列は、前記複数の固体支持体中
の他の固体支持体からの第１のバーコード配列とは異なる、ステップと、
（ｄ）前記バーコード配列の情報を前記標的核酸のフラグメントに転移させるステップ
であって、同じ前記標的核酸の少なくとも２つのフラグメントが同一のバーコード情報を
受け取る、ステップと
（ｅ）前記標的核酸のフラグメントの配列及び前記バーコード配列を決定するステップ
と、
（ｆ）前記バーコード配列を識別することにより、前記標的核酸の連続性情報を決定す
るステップと
を含む、標的核酸配列の連続性情報を決定する方法。
【請求項３】
（ａ）標的核酸を複数のトランスポソーム複合体と接触させるステップであって、
各トランスポソーム複合体は、トランスポゾン及びトランスポザーゼを含み、
前記トランスポゾンは、転移鎖及び非転移鎖を含み、前記トランスポソーム複合体の
少なくとも１つの前記トランスポゾンは、相補的な捕捉配列にハイブリダイズすることが
可能なアダプター配列を含む、ステップと、
（ｂ）前記標的核酸を複数のフラグメントにフラグメント化し、前記標的核酸の連続性
を維持しながら複数の転移鎖を挿入するステップと、
（ｃ）前記標的核酸の前記複数のフラグメントを複数の固体支持体と接触させるステッ
プであって、前記複数の固体支持体の各々は複数の固定化オリゴヌクレオチドを含み、各
前記オリゴヌクレオチドは相補的な捕捉配列及び第１のバーコード配列を含み、前記複数
の固体支持体中の各固体支持体からの第１のバーコード配列は、前記複数の固体支持体中
の他の固体支持体からの第１のバーコード配列とは異なる、ステップと、
（ｄ）前記バーコード配列の情報を前記標的核酸のフラグメントに転移させるステップ
であって、同じ前記標的核酸の少なくとも２つのフラグメントが同一のバーコード情報を
受け取る、ステップと
（ｅ）バーコードを含む前記標的核酸のフラグメントを亜硫酸水素塩処理に付し、それ
によりバーコードを含む亜硫酸水素塩処理標的核酸フラグメントを生成させるステップと
、
（ｆ）前記亜硫酸水素塩処理標的核酸フラグメントの配列及び前記バーコード配列を決
定するステップと、
（ｇ）前記バーコード配列を識別することにより、前記標的核酸の連続性情報を決定す
るステップとを含み、
前記配列情報は、前記標的核酸のメチル化状態を示し、前記連続性情報は、ハプロタイ
プ情報を示す、
標的核酸配列のフェージング情報及びメチル化状態を同時に決定する方法。
【請求項４】
単一のバーコード配列が、各個々の前記固体支持体上の前記複数の固定化オリゴヌクレ
オチドに存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
異なるバーコード配列が、各個々の前記固体支持体上の前記複数の固定化オリゴヌクレ
オチドに存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記バーコード配列情報の前記標的核酸フラグメントへの転移を、ライゲーションによ
り行う、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記バーコード配列情報の前記標的核酸フラグメントへの転移を、ポリメラーゼ伸長に
より行う、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記バーコード配列情報の前記標的核酸フラグメントへの転移を、ライゲーション及び
ポリメラーゼ伸長の両方により行う、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリメラーゼ伸長を、ライゲートされた前記固定化オリゴヌクレオチドを鋳型とし
て用い、ライゲートされていない前記トランスポゾン鎖の３’末端をＤＮＡポリメラーゼ
で伸長することにより行う、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アダプター配列の少なくとも一部が、第２のバーコード配列をさらに含む、請求項
１～９のいずれか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年１０月１７日出願
の米国仮特許出願第６２／０６５，５４４号及び２０１５年５月５日出願の米国仮特許出
願第６２／１５７，３９６号の優先権を主張する。
続きを表示（約 4,900 文字）【０００２】
本発明の実施形態は、核酸のシークエンシングに関する。具体的には、本明細書で提供
する方法及び組成物の実施形態は、核酸鋳型の調製及び核酸鋳型からの配列データの取得
に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体試料中に存在する特定の核酸配列の検出は、例えば、微生物の同定及び分類、感染
症の診断、遺伝子異常の検出及び特徴付け、癌に関連した遺伝子変化の同定、疾患への遺
伝的感受性の研究、並びに様々な種類の治療に対する反応の測定を行う方法として用いら
れてきた。生体試料中の特定の核酸配列を検出する一般的な技術は、核酸シークエンシン
グである。
【０００４】
核酸シークエンシング法は、Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔが用いた化学分解法、及び
Ｓａｎｇｅｒが用いた鎖伸長法から著しく発展してきた。今日、核酸の並列処理を全て１
回のシークエンシングランで行うことを可能にする、いくつかのシークエンシング法が用
いられている。従って、１回のシークエンシングランから生成される情報は、膨大なもの
となる可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの態様において、本明細書は、標的核酸のバーコード化ＤＮＡフラグメントのライ
ブラリーを調製する方法について記載する。当該方法は、標的核酸を複数のトランスポソ
ーム複合体と接触させることを含むものであり、各トランスポソーム複合体は、トランス
ポゾン及びトランスポザーゼを含み、トランスポゾンは転移鎖及び非転移鎖を含む。トラ
ンスポソーム複合体の少なくとも１つのトランスポゾンは、相補的な捕捉配列にハイブリ
ダイズすることが可能なアダプター配列を含む。標的核酸を複数のフラグメントにフラグ
メント化し、標的核酸の連続性（ｃｏｎｔｉｇｕｉｔｙ）を維持しながらフラグメントの
少なくとも１つの鎖の５’末端に複数の転移鎖を挿入する。標的核酸の複数のフラグメン
トを複数の固体支持体と接触させる。複数の固体支持体の各々は複数の固定化オリゴヌク
レオチドを含み、各オリゴヌクレオチドは相補的な捕捉配列及び第１のバーコード配列を
含み、複数の固体支持体中の各固体支持体からの第１のバーコード配列は、複数の固体支
持体中の他の固体支持体からの第１のバーコード配列とは異なる。バーコード配列の情報
を標的核酸のフラグメントに転移させ、それにより、同じ標的核酸の少なくとも２つのフ
ラグメントが同一のバーコード情報を受け取るように、少なくとも１つの鎖が第１のバー
コード配列で５’タグ化された、二本鎖フラグメントの固定化ライブラリーを作製する。
【０００６】
１つの態様において、本明細書は、標的核酸配列の連続性情報を決定する方法について
記載する。当該方法は、標的核酸を複数のトランスポソーム複合体と接触させることを含
むものであり、各トランスポソーム複合体は、トランスポゾン及びトランスポザーゼを含
み、トランスポゾンは転移鎖及び非転移鎖を含み、トランスポソーム複合体のトランスポ
ゾンの少なくとも１つは、相補的な捕捉配列にハイブリダイズすることが可能なアダプタ
ー配列を含む。標的核酸を複数のフラグメントにフラグメント化し、標的核酸の連続性を
維持しながら複数の転移鎖を複数のフラグメントに挿入する。標的核酸の複数のフラグメ
ントを複数の固体支持体と接触させる。複数の固体支持体の各々は複数の固定化オリゴヌ
クレオチドを含み、各オリゴヌクレオチドは相補的な捕捉配列及び第１のバーコード配列
を含み、複数の固体支持体中の各固体支持体からの第１のバーコード配列は、複数の固体
支持体中の他の固体支持体からの第１のバーコード配列とは異なる。バーコード配列情報
を、同じ標的核酸の少なくとも２つのフラグメントが同一のバーコード情報を受け取るよ
うに、標的核酸フラグメントに転移させる。標的核酸フラグメントの配列及びバーコード
配列を決定する。標的核酸の連続性情報を、バーコード配列を識別することにより決定す
る。いくつかの実施形態において、トランスポソーム複合体のトランスポザーゼを転位（
ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）後に除去し、続いて、トランスポゾンのアダプター配列を
相補的な捕捉配列にハイブリダイズさせる。いくつかの実施形態において、トランスポザ
ーゼをＳＤＳ処理により除去する。いくつかの実施形態において、トランスポザーゼをタ
ンパク質分解酵素処理により除去する。
【０００７】
１つの態様において、本明細書は、標的核酸配列のフェージング情報及びメチル化状態
を同時に測定する方法について記載する。当該方法は、標的核酸を複数のトランスポソー
ム複合体と接触させることを含むものであり、各トランスポソーム複合体は、トランスポ
ゾン及びトランスポザーゼを含み、トランスポゾンは転移鎖及び非転移鎖を含み、トラン
スポソーム複合体のトランスポゾンの少なくとも１つは、相補的な捕捉配列にハイブリダ
イズすることが可能なアダプター配列を含む。標的核酸を複数のフラグメントにフラグメ
ント化し、標的核酸の連続性を維持しながら複数の転移鎖を標的核酸フラグメントに挿入
する。標的核酸の複数のフラグメントを複数の固体支持体と接触させ、複数の固体支持体
の各々は複数の固定化オリゴヌクレオチドを含み、各オリゴヌクレオチドは相補的な捕捉
配列及び第１のバーコード配列を含み、複数の固体支持体中の各固体支持体からの第１の
バーコード配列は、複数の固体支持体中の他の固体支持体からの第１のバーコード配列と
は異なる。バーコード配列情報を、同じ標的核酸の少なくとも２つのフラグメントが同一
のバーコード情報を受け取るように、標的核酸フラグメントに転移させる。バーコードを
含む標的核酸フラグメントを亜硫酸水素塩処理に付し、それにより、バーコードを含む亜
硫酸水素塩処理標的核酸フラグメントを生成する。亜硫酸水素塩処理標的核酸フラグメン
トの配列及びバーコード配列を決定する。標的核酸の連続性情報を、バーコード配列を識
別することにより決定する。
【０００８】
１つの態様において、本明細書は、タグ化ＤＮＡフラグメントの固定化ライブラリーを
調製する方法について記載する。当該方法は、それに固定化されたトランスポソーム複合
体を有する複数の固体支持体を提供することを含み、トランスポソーム複合体は多量体で
あり、同じトランスポソーム複合体のトランスポソーム単量体単位は互いに結合し、トラ
ンスポソーム単量体単位は第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、
第１のポリヌクレオチドは、（ｉ）トランスポゾン末端配列を含む３’部分、及び（ｉｉ
）第１のバーコードを含む第１のアダプターを含む。標的ＤＮＡを、標的ＤＮＡがトラン
スポソーム複合体によりフラグメント化され、第１のポリヌクレオチドの３’トランスポ
ゾン末端配列がフラグメントの少なくとも１つの鎖の５’末端に転移する条件下で、複数
の固体支持体に適用する。それにより、少なくとも１つの鎖が第１のバーコードで５’タ
グ付けされた二本鎖フラグメントの固定化ライブラリーを作製する。
【０００９】
１つの態様において、本明細書は、標的核酸のメチル化状態を決定するためのシークエ
ンシングライブラリーを調製する方法について記載する。当該方法は、標的核酸を２つ又
はそれ以上のフラグメントにフラグメント化することを含む。第１の共通アダプター配列
を標的核酸のフラグメントの５’末端に組み込み、アダプター配列は、第１のプライマー
結合配列及び親和性部分を含み、親和性部分は、結合ペアの１つのメンバーに存在する。
標的核酸フラグメントを変性させる。標的核酸フラグメントを固体支持体に固定化する。
固体支持体は、結合ペアの他のメンバーを含み、標的核酸の固定化は、結合ペアの結合に
より行う。固定化標的核酸フラグメントを亜硫酸水素塩処理に付す。第２の共通アダプタ
ー配列を亜硫酸水素塩処理した固定化標的核酸フラグメントに組み込み、第２の共通アダ
プターは、第２のプライマー結合部位を含む。固体支持体に固定化された亜硫酸水素塩処
理固定化標的核酸フラグメントを増幅し、それにより、標的核酸のメチル化状態を決定す
るためのシークエンシングライブラリーを作製する。
【００１０】
１つの態様において、本明細書は、標的核酸のメチル化状態を決定するためのシークエ
ンシングライブラリーを調製する方法について記載する。当該方法は、それに固定化され
た固定化トランスポソーム複合体を含む複数の固体支持体を提供することを含む。トラン
スポソーム複合体は、トランスポゾン及びトランスポザーゼを含み、トランスポゾンは、
転移鎖及び非転移鎖を含む。転移鎖は、（ｉ）トランスポザーゼ認識配列を含む３’末端
の第１の部分及び（ｉｉ）第１のアダプター配列及び結合ペアの第１のメンバーを含む５
’から第１の部分に位置する第２の部分を含む。結合ペアの第１のメンバーは、固体支持
体上で結合ペアの第２のメンバーに結合し、それにより、トランスポゾンを固体支持体に
固定化する。第１のアダプターはまた、第１のプライマー結合配列を含む。非転移鎖は、
（ｉ）トランスポザーゼ認識配列を含む５’末端の第１の部分及び（ｉｉ）３’末端の末
端ヌクレオチドがブロックされている第２のアダプター配列を含む３’から第１の部分に
位置する第２の部分を含む。第２のアダプターはまた、第２のプライマー結合配列を含む
。標的核酸を、固定化トランスポソーム複合体を含む複数の固体支持体と接触させる。標
的核酸を複数のフラグメントにフラグメント化し、複数の転移鎖をフラグメントの少なく
とも１つの鎖の５’末端に挿入し、それにより、標的核酸フラグメントを固体支持体に固
定化する。フラグメント化された標的核酸の３’末端を、ＤＮＡポリメラーゼで伸長させ
る。非転移鎖を、フラグメント化された標的核酸の３’末端にライゲートする。固定化標
的核酸フラグメントを亜硫酸水素塩処理に付す。亜硫酸水素塩処理中に損傷を受けた固定
化標的核酸フラグメントの３’末端を、固定化標的核酸フラグメントの３’末端がホモポ
リマーテイルを含むように、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させる。第２のアダプター
配列を、亜硫酸水素塩処理中に損傷を受けた固定化標的核酸フラグメントの３’末端に導
入する。固体支持体に固定化された亜硫酸水素塩処理標的核酸フラグメントを、第１及び
第２のプライマーを用いて増幅し、それにより、標的核酸のメチル化状態を決定するため
のシークエンシングライブラリーを作製する。
（【００１１】以降は省略されています）

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