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公開番号2024059930
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-05-01
出願番号2024030992,2022176190
出願日2024-03-01,2019-02-01
発明の名称タンパク質二量体化を特徴解析するためのシステムおよび方法
出願人リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類G01N 33/68 20060101AFI20240423BHJP(測定;試験)
要約【課題】タンパク質のサブドメインレベルで、二量体化インターフェースを特徴解析するシステムおよび方法が提供される。
【解決手段】方法例は、タンパク質二量体サンプルをサブドメインへと消化する工程と、消化されたタンパク質サンプルを標識する工程と、標識された二量体サブドメイン断片および単量体サブドメイン断片を単離する工程と、標識されたサンプルにペプチドマッピングを行い、二量体断片が標識された部位、および二量体断片が標識されていない部位を決定する工程と、を含む。単量体分画よりも二量体分画で標識度の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していると推定される。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
タンパク質医薬中の非共有結合性相互作用部位または二量体化インターフェースを特定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
ネイティブ条件下でタンパク質医薬の制限消化を行い、単量体と非共有結合性二量体とを含有するタンパク質医薬二量体サンプル混合物を形成させる、工程；
前記タンパク質医薬二量体サンプル混合物の前記二量体および前記単量体に、検出可能な修飾を導入して、修飾二量体および修飾単量体を生成する、工程；
ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーを使用して前記修飾二量体および前記修飾単量体を、修飾二量体分画および修飾単量体分画へと分離させる、工程；
前記修飾二量体分画および前記修飾単量体分画を消化して、ペプチドサンプルを形成させる、工程；
液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して前記ペプチドサンプルを分離させ、前記ペプチドサンプルの質量分析データを取得する、工程；および
前記タンパク質医薬の各ペプチドおよび修飾ペプチドの質量を算出することにより、前記タンパク質医薬の公知の質量データと比較された前記ペプチドの前記質量分析データを使用して、前記ペプチドサンプル中の各ペプチドの修飾部位を決定する、工程。
続きを表示（約 780 文字）【請求項２】
ネイティブ制限消化条件が、ポリペプチド間のジスルフィド結合、および二量体間の非共有結合性相互作用を保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記二量体および前記単量体が、迅速光化学酸化により修飾されて、前記二量体および前記単量体内に検出可能な酸化修飾を形成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質医薬が、抗体もしくはその抗原結合断片、組み換えタンパク質、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質医薬が抗体であり、前記混合物中の前記二量体が本質的に２つの相互作用するＦ（ａｂ’）断片またはＦ（ａｂ）断片からなる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質医薬が抗体であり、前記混合物中の前記単量体が本質的にＦ（ａｂ）断片およびＦｃ断片からなる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記修飾が、アミノ酸側鎖の修飾である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、モノクローナル抗体、二特異性抗体、またはその抗原結合断片である、請求項４～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーが、酢酸アンモニウムと重炭酸アンモニウムを含有する移動相を使用して実施される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記消化されたタンパク質サンプルが、逆相液体クロマトグラフィーを用いて分離される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月２日に出願された米国仮特許出願第６２／６２５，７３２号明細書、および２０１８年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／７３８，０５１号明細書に対する優先権の利益を主張するものであり、両出願はその全体で参照により本明細書に援用される。
続きを表示（約 1,600 文字）【０００２】
発明の分野
本発明は概して、タンパク質およびその断片中の非共有結合性相互作用を特徴解析するための分析的方法およびシステムを目的とする。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
過去２０年にわたり、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を採用して広範な治療領域を標的とすることに成功している（ＷａｌｓｈＧ．，Ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１４；３２：９９２－１０００（非特許文献１）；ＬａｗｒｅｎｃｅＳ．Ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２００７；２５：３８０－２（非特許文献２））。タンパク質凝集は、モノクローナル抗体および他の治療用タンパク質の製造において未だ主要な懸念点である。有効性と免疫原性に影響を与える可能性があるために、凝集メカニズムを理解し、適切な制御戦略を実装して製品の質を保証できるようにすることが重要である。
【０００４】
ｍＡｂ分子中の二量体化インターフェースのマッピングは、ｍＡｂ二量体のその複雑性と不均一性のために未だ困難な課題である。水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸＭＳ：ｈｙｄｒｏｇｅｎ－ｄｅｕｔｅｒｉｕｍｅｘｃｈａｎｇｅｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）により、タンパク質－タンパク質の相互作用の解明には成功しているが、ｍＡｂ二量体化インターフェースの解明にはほとんど至っておらず、恐らくこれはタンパク質側鎖の相互作用を検出する方法に限界があるためと思われる。
【０００５】
ゆえに本発明の目的は、タンパク質の不均一な二量体化インターフェースをマッピングするためのシステムおよび方法を提供することである。
【０００６】
本発明のもう１つの目的は、二量体化レベルが減少したタンパク質医薬を提供することである。
【０００７】
本発明のさらにもう１つの目的は、二量体化が減少したタンパク質医薬を製造する方法を提供することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
ＷａｌｓｈＧ．，Ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１４；３２：９９２－１０００
ＬａｗｒｅｎｃｅＳ．Ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２００７；２５：３８０－２
【発明の概要】
【０００９】
タンパク質のペプチド／残基のレベルで、タンパク質二量体化インターフェースを特徴解析するシステムおよび方法が提供される。方法の例としては、タンパク質二量体サンプルをサブドメインへと消化する工程と、消化されたタンパク質サンプル混合物を標識する工程と、標識された二量体サブドメイン断片および単量体サブドメイン断片を単離する工程と、標識されたサンプルにペプチドマッピングを行い、二量体中、および単量体中の標識度を決定および比較する工程と、を含む。単量体分画よりも二量体分画で標識度の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していると推定される。
【００１０】
１つの実施形態では、非共有結合性二量体が単離され、ペプチドマッピングにより分析されて、非共有結合性相互作用部位の場所が決定される。ペプチド／残基レベルで、非共有結合性二量体化インターフェースの場所を決定する別の実施形態では、富化ｍＡｂ二量体サンプルが、Ｆ（ａｂ）［またはＦ（ａｂ’）］ホモ二量体、Ｆ（ａｂ）［またはＦ（ａｂ’）］単量体、およびＦｃの単量体の混合物へと消化され、標識実験が行われる。次いで分別、トリプシン消化、およびＬＣ－ＭＳ分析が行われて、ペプチド／残基レベルでの標識度の定量と比較が行われた。本開示方法の工程の詳細は以下に提示される。
（【００１１】以降は省略されています）

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