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公開番号2025172866
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-11-26
出願番号2025141852,2022534204
出願日2025-08-28,2021-03-31
発明の名称多重特異性抗原結合分子を製造するための方法
出願人中外製薬株式会社
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C07K 1/02 20060101AFI20251118BHJP(有機化学)
要約【課題】多重特異性抗原結合分子の調製物を製造するための方法、および調製物を提供する。
【解決手段】方法は、多重特異性抗原結合分子が、以下:(a)それぞれが第1の抗原および第1の抗原とは異なる第2の抗原に結合できるが、両方の抗原に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分;ならびに(b)第1および第2の抗原とは異なる第3の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる、第3の抗原結合部分を含み、第1および第2の抗原結合部分のそれぞれが、ヒンジ領域内にはない少なくとも1つのシステイン残基を含み、好ましくは、少なくとも1つのシステインがCH1領域内に位置しており;少なくとも1つのシステイン残基が、好ましくはCH1領域において、第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に少なくとも1つのジスルフィド結合を形成でき;方法が、調製物を還元試薬と接触させる段階を含む。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
多重特異性抗原結合分子の調製物を製造するための方法であって、該多重特異性抗原結合分子が、以下：
（a）それぞれが第1の抗原および第1の抗原とは異なる第2の抗原に結合できるが、両方の抗原に同時には結合しない、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分；ならびに
（b）第1のおよび第2の抗原とは異なる第3の抗原、好ましくはがん細胞/組織上に発現している抗原に結合できる、第3の抗原結合部分
を含み、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、ヒンジ領域内にはない少なくとも1つのシステイン残基を（変異、置換、または挿入を介して）含み、好ましくは、該少なくとも1つのシステインがCH1領域内に位置しており；該少なくとも1つのシステイン残基が、好ましくはCH1領域において、第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分との間に少なくとも1つのジスルフィド結合を形成でき；
該方法が、該調製物を還元試薬と接触させる段階を含む、前記方法。
続きを表示（約 3,000 文字）【請求項２】
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のそれぞれが、
第1の抗原結合部分のCH1領域と第2の抗原結合部分のCH1領域との間に1つのジスルフィド結合を形成できる、CH1領域におけるEUナンバリングによる191位にある1つのシステイン残基
を（変異、置換、または挿入を介して）含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記多重特異性抗原結合分子調製物（還元剤と接触させる前）が、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合だけ異なっている2つ以上の構造アイソフォームを含み、かつ還元剤と接触させる段階が、CH1領域に位置しているかまたはCH1領域における191位（EUナンバリング）にあるアミノ酸残基間に形成される少なくとも1つのジスルフィド結合を有する構造アイソフォームの集団を優先的に濃縮するかまたは増加させる、請求項2記載の方法。
【請求項４】
多重特異性抗原結合分子と接触させる前記還元試薬のpHが約3から約10、好ましくはpH 6～8である、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
還元剤が、TCEP、2-MEA、DTT、システイン、GSH、およびNa
2
SO
3
、好ましくは TCEPからなる群より選択される、請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
還元剤の濃度が約0.01 mMから約100 mMである、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
多重特異性抗原結合分子の濃度が約0.1 mg/mlから約50 mg/ml、好ましくは約10 mg/mlである、請求項1～6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
好ましくは透析またはバッファー交換によって好ましくは還元剤を除去することによって、システインジスルフィド結合の再酸化を促進する段階
をさらに含む、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分の各々が、CD3およびCD137に結合できるが、CD3およびCD137の両方に同時には結合しない、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれ、以下の（a1）～（a17）：
（a1）配列番号：17の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：31の重鎖CDR 2、配列番号：45の重鎖CDR 3、配列番号：64の軽鎖CDR 1、配列番号：69の軽鎖CDR 2、および配列番号：74の軽鎖CDR 3；
（a2）配列番号：18の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：32の重鎖CDR 2、配列番号：46の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a3）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a4）配列番号：19の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：33の重鎖CDR 2、配列番号：47の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a5）配列番号：20の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：34の重鎖CDR 2、配列番号：48の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a6）配列番号：22の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：36の重鎖CDR 2、配列番号：50の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a7）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a8）配列番号：23の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：37の重鎖CDR 2、配列番号：51の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a9）配列番号：24の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：38の重鎖CDR 2、配列番号：52の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a10）配列番号：25の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：39の重鎖CDR 2、配列番号：53の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a11）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：66の軽鎖CDR 1、配列番号：71の軽鎖CDR 2、および配列番号：76の軽鎖CDR 3；
（a12）配列番号：26の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：40の重鎖CDR 2、配列番号：54の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a13）配列番号：27の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：41の重鎖CDR 2、配列番号：55の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a14）配列番号：28の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：42の重鎖CDR 2、配列番号：56の重鎖CDR 3、配列番号：63の軽鎖CDR 1、配列番号：68の軽鎖CDR 2、および配列番号：73の軽鎖CDR 3；
（a15）配列番号：82の重鎖相補性決定領域（CDR） 1、配列番号：83の重鎖CDR 2、配列番号：84の重鎖CDR 3、配列番号：65の軽鎖CDR 1、配列番号：70の軽鎖CDR 2、および配列番号：75の軽鎖CDR 3；
（a16）（a1）～（a15）から選択される抗体可変領域のいずれかのと同じエピトープに結合する抗体可変領域；ならびに
（a17）（a1）～（a15）から選択される抗体可変断片のいずれかの結合と競合する抗体可変断片
のいずれか1つを含む抗体可変領域を含む、請求項9記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも1つのジスルフィド結合を介して相互に連結することができる2つ以上の抗原結合部分を含む多重特異性抗原結合分子、およびそのような多重特異性抗原結合分子を製造するための方法に関する。より詳細には、本発明は、好ましい形態の多重特異性抗体タンパク質を増加させるかまたは濃縮するための方法、およびそのような組換え抗体タンパク質のジスルフィド不均一性を除去するための方法に関する。
続きを表示（約 4,000 文字）【背景技術】
【０００２】
抗体は、血漿中で極めて安定でありかつ副作用がほとんどないことから、医薬として注目を集めている。多数の治療用抗体のうち、一部の種類の抗体は、抗腫瘍反応を発揮するためにエフェクター細胞を必要とする。抗体依存性細胞傷害（ADCC）は、NK細胞およびマクロファージ上に存在するFc受容体への抗体のFc領域の結合を介して、エフェクター細胞が抗体結合細胞に対して呈する細胞傷害である。がんを治療するための医薬として、これまで、ADCCを誘導して抗腫瘍効果を発揮できる複数の治療用抗体が開発されている（Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078）。
【０００３】
エフェクター細胞としてNK細胞またはマクロファージを動員することによってADCCを誘導する抗体に加えて、エフェクター細胞としてT細胞を動員することによって細胞傷害性を取り入れるT細胞動員抗体（TR抗体）が、1980年代から知られている（非特許文献2～4）。TR抗体は、T細胞上のT細胞受容体複合体を形成するサブユニットのいずれか1つ、特にCD3ε鎖と、がん細胞上の抗原とを認識し、かつそれらに結合する二重特異性抗体である。いくつかのTR抗体が現在開発されている。カツマキソマブ（Catumaxomab）は、EpCAMに対するTR抗体であり、悪性腹水症の治療に関して欧州で承認されている。さらに、「二重特異性T細胞誘導（BiTE）」と呼ばれる種類のTR抗体が、強力な抗腫瘍活性を示すことが近年見出されている（非特許文献5および6）。ブリナツモマブ（Blinatumomab）は、CD19に対するBiTE分子であり、2014年に最初にFDAの承認を受けた。ブリナツモマブは、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および補体依存性細胞傷害（CDC）を誘導するリツキシマブ（Rituximab）と比較して、CD19/CD20陽性がん細胞に対してはるかに強い細胞傷害活性をin vitroで示すことが証明されている（非特許文献7）。
【０００４】
しかしながら、三機能性抗体は、がん抗原非依存的に、T細胞とNK細胞またはマクロファージなどの細胞との両方に同時に結合し、結果として、これらの細胞上に発現している受容体が架橋され、種々のサイトカインの発現が抗原非依存的に誘導されることが公知である。三機能性抗体の全身投与は、そのようなサイトカイン発現の誘導の結果として、サイトカインストーム様の副作用を引き起こすと考えられる。実際、第I相臨床試験において、非小細胞肺がんを有する患者に対するカツマキソマブの全身投与での最大耐容量が5 μg/bodyという超低用量であったこと、およびより高用量の投与が、様々な重篤な副作用を引き起こすことが報告されている（非特許文献8）。そのような低用量で投与した場合、カツマキソマブは、有効血中レベルに到達することはできない。すなわち、そのような低用量でカツマキソマブを投与することによって、期待される抗腫瘍作用を達成することはできない。
【０００５】
近年、FcγRに対する結合活性を低下させたFc領域を用いることで、有害反応を回避しつつ、T細胞によって媒介される細胞傷害活性を引き起こす改良型抗体が提供されている（特許文献1）。しかしながら、このような抗体であっても、その分子構造を踏まえると、がん抗原に結合しつつ2つの免疫受容体、すなわち、CD3εおよびFcγRに作用することはできない。有害反応を回避しつつ、がん抗原特異的な様式で、T細胞によって媒介される細胞傷害活性と、T細胞以外の細胞によって媒介される細胞傷害活性との両方を発揮する抗体は、まだ知られていない。
【０００６】
一方で、カツマキソマブとは異なり、二重特異性sc（Fv）2フォーマット分子（BiTE）は、Fcγ受容体結合部位を有さないことから、T細胞上ならびにNK細胞およびマクロファージなどの細胞上に発現している受容体をがん抗原非依存的に架橋しない。しかしながら、二重特異性 sc（Fv）2は、Fc領域を有さない改変された低分子量抗体分子であることから、患者への投与後のその血中半減期が、治療用抗体として通常用いられるIgG型の抗体より著しく短いという問題がある。実際、in vivoで投与された二重特異性 sc（Fv）2の血中半減期は、およそ数時間であると報告されている（非特許文献9および10）。ブリナツモマブ、すなわち、CD19およびCD3に結合するsc（Fv）2分子は、急性リンパ性白血病の治療に関して承認されている。ブリナツモマブの血清半減期は、患者中で2時間未満であることが明らかになっている（非特許文献11）。ブリナツモマブの臨床試験では、ブリナツモマブは、ミニポンプを用いる持続点滴静注によって投与された。この投与方法は、患者にとって極めて不便であるだけでなく、デバイスの誤作動などによる医療事故の危険性の可能性もまた有する。したがって、そのような投与方法は望ましいものであるとは言えない。
【０００７】
T細胞は、腫瘍免疫において重要な役割を果たし、１）主要組織適合複合体（MHC）クラスI分子によって提示される抗原ペプチドに対するT細胞受容体（TCR）の結合およびTCRの活性化；ならびに２）抗原提示細胞上のリガンドに対するT細胞の表面上の共刺激分子の結合および共刺激分子の活性化、の2つのシグナルによって活性化されることが知られている。さらに、腫瘍壊死因子（TNF）スーパーファミリーおよびTNF受容体スーパーファミリーに属する分子、例えばT細胞の表面上のCD137（4-1BB）の活性化は、T細胞活性化に重要であると説明されている（非特許文献12）。これに関連して、CD137アゴニスト抗体は、抗腫瘍効果を示すことが既に実証されており、これは、主にCD8陽性T細胞およびNK細胞の活性化により、実験的に示されている（非特許文献13）。細胞外ドメインとしての腫瘍抗原結合ドメイン、ならびに細胞内ドメインとしてのCD3およびCD137シグナル伝達ドメインからなるキメラ抗原受容体分子を有するように操作されたT細胞（CAR-T細胞）は、効力の持続性を増強することができる（Porter, N ENGL J MED, 2011, 365;725-733（非特許文献14））。しかし、そのようなCD137アゴニスト抗体のその非特異的肝毒性による副作用は、臨床上および非臨床上問題であり、薬剤の開発は前進していない（Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 28, 512-22（非特許文献15））。副作用の主な原因は、抗体定常領域を介したFcγ受容体に対する抗体の結合が関与していることが示唆されている（Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22（非特許文献16））。さらに、TNF受容体スーパーファミリーに属する受容体を標的とするアゴニスト抗体がin vivoでアゴニスト活性を発揮するためには、Fcγ受容体発現細胞（FcγRII発現細胞）による抗体架橋が必要であることが報告されている（Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6（非特許文献17））。WO2015/156268（特許文献2）は、CD137アゴニスト活性を有する結合ドメインと腫瘍特異的抗原に対する結合ドメインとを有する二重特異性抗体が、腫瘍特異的抗原を発現する細胞の存在下でのみ、CD137アゴニスト活性を発揮し、かつ免疫細胞を活性化することができることを記載している。
【０００８】
腫瘍特異的抗原（EGFR）結合ドメイン、CD137結合ドメイン、およびCD3結合ドメインを含む三重特異性抗体は、既に報告されている（WO2014116846）。しかしながら、そのような分子フォーマットを有する抗体は、3種類の異なる抗原に同時に結合できることから、それらの三重特異性抗体は、CD3およびCD137に同時に結合することによって、CD3ε発現T細胞とCD137発現細胞（例えば、T細胞、B細胞、NK細胞、DCなど）との間に架橋形成をもたらし得ることが推測された。この脈絡において、有害反応を回避しつつ、T細胞によって媒介される細胞傷害活性と、CD137を介するT細胞および他の免疫細胞の活性化活性との両方をがん抗原特異的に発揮する抗体は、まだ知られていない。
【０００９】
複数のジスルフィド結合を有する抗体では、抗体調製物間の構造不均一性が観察されているが、この不均一性の背景にある理由は依然解明されていない。例えば、米国特許出願公開第2005/0161399号、Dillon et al.は、抗体を含む高分子量タンパク質を分析する逆相LC/MS法について論じている。加えて、米国特許出願公開第2006/194280号、Dillon et al.は、組換えIgGタンパク質の調製物を還元/酸化カップリング試薬および任意でカオトロピック剤に供することによって、特定のIgGアイソフォームを一過性に濃縮する方法に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
WO2012/073985
WO2015/156268
WO2014116846
【非特許文献】
（【００１１】以降は省略されています）

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