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公開番号2025168346
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-11-07
出願番号2025123833,2022518227
出願日2025-07-24,2020-09-18
発明の名称DNA塩基編集のための方法及び組成物
出願人シンジェンタクロッププロテクションアクチェンゲゼルシャフト
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C07K 19/00 20060101AFI20251030BHJP(有機化学)
要約【課題】細胞のゲノム中の標的部位を改変するための方法及び組成物を提供すること。
【解決手段】改善されたリンカー配列で接続されている1個又は複数個のDNA結合ドメイン及び1個又は複数個の異種ドメイン、例えばDNA改変ドメインを含む、融合タンパク質を提供する。改善されたリンカー配列により接続されている1個又は複数個のDNA結合ドメイン及び1個又は複数個の異種ドメインを含む融合タンパク質をコードする、コドン最適化ポリヌクレオチドを提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端の方向に、異種ドメイン、第１のリンカー配列、及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素を含む融合タンパク質であって、前記第１のリンカー配列が、反復ＧＧＧＧＳ配列を含む、融合タンパク質。
続きを表示（約 750 文字）【請求項２】
前記異種ドメインが、デアミナーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、リラクサーゼ、アルキルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、オキシダーゼ、チミンアルキルトランスフェラーゼ、アデニンオキシダーゼ、アデノシンメチルトランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、又は核局在化シグナルである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記異種ドメインが、デアミナーゼドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記デアミナーゼドメインが、シチジンデアミナーゼである、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記シチジンデアミナーゼドメインが、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（「ＡＩＤ」）である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記シチジンデアミナーゼドメインが、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体（「ＡＰＯＢＥＣ」）ドメインである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ＡＰＯＢＥＣドメインが、ＡＰＯＢＥＣ１ファミリのデアミナーゼである、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ＡＰＯＢＥＣドメインが、配列番号１と少なくとも７０％同一の配列を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記デアミナーゼドメインが、アデニンデアミナーゼである、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記アデニンデアミナーゼが、ＴａｄＡドメインである、請求項９に記載の融合タンパク質。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞のゲノム中における標的ヌクレオチド塩基編集のための方法及び組成物に関する。
続きを表示（約 3,300 文字）【０００２】
配列表の電子的提出に関する陳述
本明細書には、２０２０年９月１８に作成されて３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１に基づいて提出された、約７０２キロバイトの、「８１９４５＿ＳＴ２５」という表題のＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表が添付されており、且つ本明細書と共に提出されており、この配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
農業では、植物のゲノムを編集して有利な対立遺伝子を作り出す能力が非常に求められている。この能力により、収量が増加したり疾患が予防されたりする可能性がある。ゲノム編集は、植物では進展が遅れている新しい分野である。さらに、意図された変更以外のゲノムに対する変更には、望ましい変更の適用が制限されるという問題がある。ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９は、ＤＮＡに二本鎖切断を行なうことにより機能する。この切断は、非相同末端結合又は相同性依存性修復により修復されることから、ＤＮＡ塩基の挿入又は欠失が起こる場合がある。塩基編集と称される戦略により、切断されて挿入及び欠失が生じることなくＤＮＡが変更される。１つのバージョンでは、シチジンデアミナーゼと称される酵素は、ＤＮＡを切断し得ないように改変されているＣＡＳ９酵素（Ｓｈｉｍａｔａｎｉｅｔａｌ，２０１７．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５，４４１－４４３）又はＣＡＳ１２ａ酵素（Ｌｉｅｔａｌ，２０１８．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，３２４－３２７）により、特定の塩基を標的とする。シチジンデアミナーゼ及びヌクレアーゼ欠損ＣＡＳ９又はＣＡＳ１２ａは、アミノ酸リンカーを介した接続により互いに融合している。リンカー接続の改善により、例えば、オフターゲット塩基変更が減少して切断の精度が改善され、これにより、この融合タンパク質の機能が改善され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この改善に関する要求を満たすために、本発明者らは、最適化されており且つ改善されているＣａｓ１２ａ酵素及び構築物を提供する。具体的には、本発明者らは、異種ドメイン、第１のリンカー配列、及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素を含む融合タンパク質を提供する。第１のリンカー配列は、反復ＧＧＧＧＳ配列を含む。異種ドメインは、デアミナーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、リラクサーゼ（ｒｅｌａｘａｓｅ）、アルキルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、オキシダーゼ、チミンアルキルトランスフェラーゼ、アデニンオキシダーゼ、アデノシンメチルトランスフェラーゼ、グリコシラーゼ、又は核局在化シグナルであり得る。塩基編集のために、異種ドメインは、デアミナーゼドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼ又はアデニンデアミナーゼ）である。シチジンデアミナーゼドメインは、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（「ＡＩＤ」）、又は例えばデアミナーゼのＡＰＯＢＥＣ１ファミリ由来のアポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体（「ＡＰＯＢＥＣ」）ドメインであり得る。状況によっては、ＡＰＯＢＥＣドメインは、配列番号１と少なくとも７０％同一の配列を含む。アデニンデアミナーゼが必要な場合には、アデニンデアミナーゼは、配列番号９２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むＴａｄＡドメインであり得る。
【０００５】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素がＶ－Ａ型（「Ｃａｓ１２ａ」）酵素である場合には、Ｃａｓ１２ａは、配列番号３、配列番号６、配列番号２２、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、及び配列番号４８で構成された群から選択される。Ｃａｓ１２ａドメインは、触媒的に不活性であり得るが、標的ＤＮＡに依然として結合して異種ドメインが作動することを可能にする。Ｃａｓ１２ａは不活性であり、この配列は、配列番号３、配列番号６、又は配列番号２２である。
【０００６】
異種ドメインとＣａｓ１２ａ酵素との間の第１のリンカー配列は、少なくとも３回反復されたＧＧＧＧＳを含み得る。他の用途では、第１のリンカー配列は、少なくとも６回反復されたＧＧＧＧＳを含み得る。
【０００７】
本融合タンパク質は、配列番号１１、１２、１３、又は４４を含み得、且つウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（「ＵＧＩ」）ドメイン（配列番号８により表される）も含み得る。このＵＧＩドメインは、配列ＳＧＧＳを含む第２のリンカーによりＣａｓ１２ａ酵素に連結され得る。この融合タンパク質は、配列番号１７、配列番号２４、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、又は配列番号８９を含み得る。これらの融合タンパク質は、ＤＮＡと接触した場合には、反復ＧＧＧＧＳ配列の第１のリンカー配列を欠く先行技術の融合タンパク質と比較して、高い頻度でオンターゲット編集を生じ、及び低い頻度でオフターゲット編集を生じる。
【０００８】
本発明者らはまた、植物ゲノムＤＮＡを編集する方法であって、植物ゲノムＤＮＡと、（ａ）ＵＧＩドメインを任意に含む、上記態様の内の１つにより説明されている融合タンパク質、及び（ｂ）工程（ａ）の融合タンパク質の標的を植物ゲノムＤＮＡの標的ＤＮＡ配列に定めるガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）とを接触させることによる方法であり、編集された植物ゲノムＤＮＡは、反復ＧＧＧＧＳ配列以外の第１のリンカーを有する融合タンパク質により編集された植物ゲノムＤＮＡと比較してオフターゲット編集が低い、方法も提供する。
【０００９】
本発明者らはまた、低いオフターゲット編集で植物ゲノムＤＮＡを編集する方法であって、植物ゲノムＤＮＡと、（ａ）ＵＧＩドメインを任意に含む、上記態様の内の１つにより説明されている融合タンパク質、及び（ｂ）工程（ａ）の融合タンパク質の標的を植物ゲノムＤＮＡの標的ＤＮＡ配列に定めるガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）と接触させることによる方法であり、編集された植物ゲノムＤＮＡは、反復ＧＧＧＧＳ配列以外の第１のリンカーを有する融合タンパク質により編集された植物ゲノムＤＮＡと比較してオフターゲット編集が低い、方法も提供する。一態様では、この融合タンパク質は、配列番号２４を含む。
【００１０】
本発明者らはまた、オフターゲット編集が低い編集植物の集団を得る方法であって、（ａ）編集されるゲノムＤＮＡを含む植物細胞の集団を得ること、（ｂ）上記態様の内の１つにより説明されている融合タンパク質及び任意のＵＧＩドメインをコードするヌクレオチド配列を得ること、（ｃ）この植物細胞の集団を工程（ｂ）のヌクレオチド配列で形質転換させ、それにより、この植物細胞の集団内で、この核酸配列によりコードされた融合タンパク質を発現させること、（ｄ）形質転換された植物細胞の集団を植物へと成長させることであり、この植物の少なくとも１つは編集されている、成長させること、並びに（ｅ）工程（ｄ）の生成物から少なくとも１つの編集植物を選択し、それにより編集植物の集団を得ることによる方法であり、この編集植物の集団は、反復ＧＧＧＧＳ配列以外の第１のリンカーを有する融合タンパク質により編集された植物と比較してオフターゲット編集が低い、方法も提供する。一態様では、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７、配列番号２４、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、又は配列番号８９を含む。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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