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公開番号2025160172
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-22
出願番号2025106768,2021557392
出願日2025-06-24,2020-03-27
発明の名称CAS9/RNPおよびAAVウイルスの組み合わせを使用したがん免疫療法のための、キメラ抗原受容体(CAR)-初代NK細胞の生成
出願人リサーチインスティテュートアットネイションワイドチルドレンズホスピタル,RESEARCH INSTITUTE AT NATIONWIDE CHILDREN’S HOSPITAL
代理人個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20251015BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】細胞を遺伝子操作する新しい方法およびベクターを提供する。
【解決手段】組み込みのためにCRISPR/CAS9系およびリボ核タンパク質のアデノ随伴ウイルス(AAV)送達を使用して、細胞を遺伝子操作するための方法が開示される。一部の態様では、当該方法を実施するためのAAVプラスミドが本明細書に開示される。
【選択図】図11
特許請求の範囲【請求項１】
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰ
Ｒ関連９（Ｃａｓ９）組み込み系とともに使用するためのプラスミドであって、前記プラ
スミドが、左相同アーム、スプライスアクセプター、導入遺伝子、および右相同アームを
順に含み、前記左相同アームおよび右相同アームが、各々８００ｂｐ以下の長さである、
プラスミド。
続きを表示（約 840 文字）【請求項２】
前記導入遺伝子と前記右相同アームとの間にポリアデニル化シグナルをさらに含む、請
求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
前記左相同アームおよび右相同アームが、同じ長さである、請求項１または２に記載の
プラスミド。
【請求項４】
前記相同アームが、３０ｂｐの長さである、請求項３に記載のプラスミド。
【請求項５】
前記相同アームが、３００ｂｐの長さである、請求項３に記載のプラスミド。
【請求項６】
前記相同アームが、５００ｂｐの長さである、請求項３に記載のプラスミド。
【請求項７】
前記相同アームが、８００ｂｐの長さである、請求項３に記載のプラスミド。
【請求項８】
前記左相同アームおよび右相同アームが、異なる長さである、請求項１または２に記載
のプラスミド。
【請求項９】
１つまたは２つのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、およびＣＲＩＳＰＲＲ
ＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および導入遺伝子からなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組み込み方法に
おいて使用するためのプラスミドであって、コードされた核酸の順序が、ＰＡＭ、ｃｒＲ
ＮＡ、および導入遺伝子を含み、２つのＰＡＭおよびｃｒＲＮＡが使用される場合、前記
コードされた核酸のが、第１のＰＡＭ、第１のｃｒＲＮＡ、導入遺伝子、第２のＰＡＭ、
および第２のｇＲＮＡを含む、プラスミド。
【請求項１０】
請求項１～８のいずれか一項に記載のプラスミドの前記相同アームおよび請求項９に記
載のプラスミドの前記ＰＡＭが、ヒトの１９番染色体のアデノ随伴ウイルス組み込み部位
１（ＡＡＶＳ１）に特異的にハイブリダイズする、請求項１～９のいずれか一項に記載の
プラスミド。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【背景技術】
【０００１】
近年、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術が細胞の操作に使用されている。この技術は、ＤＮ
Ａ切断を生成するか、または小さな置換もしくは小さな挿入を行うことによって、遺伝子
をサイレンシングするためのロバストな方法であることが証明されている。しかしながら
、その技術は、技術的なハードルに悩まされている。マイクロインジェクション、エレク
トロポレーション、およびヌクレオフェクションなどの（任意のドナーＤＮＡまたはＲＮ
Ａとともに）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を細胞に送達するための技術は、インビボでの使用
には適していない。さらに、ノックイン変異は、典型的には、インビトロ、インビボ、お
よび臨床応用において非常に低い効率を有する。ウイルスベクターを使用して（任意のド
ナーＤＮＡまたはＲＮＡとともに）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を細胞内に送達することは、
インビボ適合性に対処するが、導入遺伝子のサイズに制限を有し、宿主免疫応答を誘導し
て、手順に関連する実質的な細胞アポトーシスをもたらし、遺伝子操作された細胞の産生
を制限する可能性がある。必要とされるのは、細胞を遺伝子操作する新しい方法およびベ
クターである。
続きを表示（約 1,300 文字）【発明の概要】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９遺伝子編集系を細胞に送達するための、ＡＡＶプラスミドに関
連する方法および組成物が開示される。一部の態様では、ＡＡＶプラスミドは、導入遺伝
子をさらに含む。
【０００３】
一態様では、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）
／ＣＲＩＳＰＲ関連９（Ｃａｓ９）組み込み系において使用するためのプラスミドが本明
細書に開示され、プラスミドは、左相同アーム、スプライスアクセプター、導入遺伝子、
および右相同アームを順に含み、左相同アームおよび右相同アームは、各々８００ｂｐ以
下の長さ（例えば、プラスミド１および２の３０ｂｐ、プラスミド３および４の３００ｂ
ｐ、プラスミド５および６の５００ｂｐ、または８００ｂｐ）である。一部の態様では、
プラスミドは、導入遺伝子と右相同アームとの間にポリアデニル化シグナルをさらに含む
ことができる。
【０００４】
左相同アームおよび右相同アームが、同じ長さまたは異なる長さである、任意の先行す
る態様のプラスミドもまた本明細書に開示される。
【０００５】
一態様では、１つまたは２つのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、およびＣＲ
ＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および導入遺伝子からなるＣＲＩＳＰａｉｎｔ（また
は非相同末端結合）方法において使用するためのプラスミドが本明細書に開示され、コー
ドされた核酸の順序は、ＰＡＭ、ｇＲＮＡ、および導入遺伝子を含み、２つのＰＡＭおよ
びｇＲＮＡが使用される場合、コードされた核酸のは、第１のＰＡＭ、第１のｇＲＮＡ、
導入遺伝子、第２のＰＡＭ、および第２のｇＲＮＡを含む。
【０００６】
一態様では、プラスミドの相同アームまたはＰＡＭが、ヒトの１９番染色体のアデノ随
伴ウイルス組み込み部位１（ＡＡＶＳ１）に特異的にハイブリダイズする、任意の先行す
る態様のプラスミドが本明細書に開示される。
【０００７】
導入遺伝子が、腫瘍抗原のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む、任
意の先行する態様のプラスミドもまた開示される。
【０００８】
一態様では、任意の先行する態様のプラスミドを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
ベクター（血清型ＡＡＶ６のＡＡＶベクターなど）が、本明細書に開示される。一態様で
は、ＡＡＶは、一本鎖ＡＡＶまたは自己相補的ＡＡＶであり得る。
【０００９】
ベクターが、ｇＲＮＡ（ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トレーサーＲＮＡ（ｔ
ｒａｃｒＲＮＡ））、およびＣＡＳエンドヌクレアーゼをコードするプラスミドをさらに
含む、任意の先行するベクターもまた本明細書に開示される。
【００１０】
一態様では、任意の先行する態様のプラスミドまたはベクターを含む改変細胞が本明細
書に開示される。
（【００１１】以降は省略されています）

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