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公開番号2025151531
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-09
出願番号2024053014
出願日2024-03-28
発明の名称リンゴガイ類の検出方法
出願人国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
代理人弁理士法人平木国際特許事務所
主分類C12Q 1/6851 20180101AFI20251002BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】環境DNAから高い検出率でリンゴガイ類を検出する。
【解決手段】特定の塩基配列を有する第1のプライマー、別の特定の塩基配列を有する第2のプライマー、及びさらに別の塩基配列を有するプローブを用いて、試料中の環境DNAを増幅・検出する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を用いて、試料中の核酸を増幅する工程、を含む、
リンゴガイ類の検出方法。
続きを表示（約 1,700 文字）【請求項２】
前記試料が、淡水環境又は土壌環境から採取された試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸が、環境ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブが、塩基配列の５’末端側及び３’末端側に蛍光物質及びクエンチャー物質をそれぞれ備える、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を含む、リンゴガイ類を検出するための試薬又はキット。
【請求項６】
リアルタイムＰＣＲ用である、請求項５に記載の試薬又はキット。
【請求項７】
以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
からなる、リンゴガイ類を検出するためのプライマーセット。
【請求項８】
以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有する、リンゴガイ類を検出するためのプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境ＤＮＡを用いてリンゴガイ類を検出する方法に関する。
続きを表示（約 3,800 文字）【背景技術】
【０００２】
スクミリンゴガイは、南米原産の淡水性巻貝の一種で、わが国には食用を目的とした養殖用として持ち込まれた後、環境中で野生化した侵略的外来種である。水田に生息して田植え後の若いイネを食害するため、害虫として防除の対象となっている。わが国には、スクミリンゴガイと非常によく似た形態を有する近縁種のラプラタリンゴガイも侵入しており、各地でスクミリンゴガイと交雑している。スクミリンゴガイとラプラタリンゴガイは、その外観や生態等からは容易には区別できない。
【０００３】
環境中のスクミリンゴガイ等のリンゴガイ類の存在の有無は、通常は、ピンク色の卵塊が周辺に存在するか否かで判定される。しかし、生息密度が低い場合には、卵塊の観測は、必ずしも確実な判定方法ではなかった。
【０００４】
環境ＤＮＡとは、海、川、湖沼等の水環境、土壌、大気等の環境中に存在する生物由来のＤＮＡの総称である。環境ＤＮＡの分析により、その環境中に存在する生物、特に水生生物の種類等を推定する技術が知られている。非特許文献１には、環境ＤＮＡから、スクミリンゴガイ及びラプラタリンゴガイのチトクローム酸化酵素１（ＣＯＩ）遺伝子を検出する方法が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
P. Banerjee, et al., Hydrobiologia (2022), 849: 4241-4257
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１に記載の方法では、環境ＤＮＡからのスクミリンゴガイ、ラプラタリンゴガイの検出率は５０～７０％であった。非特許文献１に記載の方法は、スクミリンゴガイとラプラタリンゴガイを区別することを目的としている。しかし、リンゴガイ類の防除を考える上で、これらを在来種と区別しながら検出することには意義はあるものの、これらのリンゴガイ間を区別することについては、両種が交雑することもあり、その意義が大きいとはいえない。そのため、スクミリンゴガイ、ラプラタリンゴガイおよびこれらの2種の交雑個体を区別なく高感度に検出することが求められている。
【０００７】
本発明は、環境ＤＮＡから高い検出率でリンゴガイ類を検出可能な方法、及び該方法に使用するための試薬又はキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書は、以下の発明を提供する。
［１］以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を用いて、試料中の核酸を増幅する工程、を含む、
リンゴガイ類の検出方法。
［２］前記試料が、淡水環境又は土壌環境から採取された試料である、［１］に記載の方法。
［３］前記核酸が、環境ＤＮＡである、［１］又は［２］のいずれかに記載の方法。
［４］前記プローブが、塩基配列の５’末端側及び３’末端側に蛍光物質及びクエンチャー物質をそれぞれ備える、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を含む、リンゴガイ類を検出するための試薬又はキット。
［６］リアルタイムＰＣＲ用である、［５］に記載の試薬又はキット。
［７］以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
からなる、リンゴガイ類を検出するためのプライマーセット。
［８］以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有する、リンゴガイ類を検出するためのプローブ：
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、環境ＤＮＡから、高い検出率でリンゴガイ類を検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
スクミリンゴガイのチトクローム酸化酵素１（ＣＯＩ）遺伝子の塩基配列上のプライマー、プローブの一例の設計位置を示す模式図である。ラプラタリンゴガイについては、３５４～４２０位に対応する塩基配列のうち、不一致の塩基のみを表示する。他の淡水性巻貝については、３８２～４０７位に対応する塩基配列のうち、不一致の塩基のみを表示する。
環境ＤＮＡの採取、検出の手順の一例を示すフロー図である。
各種淡水性巻貝の組織及び飼育水由来のＤＮＡ溶液の定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。縦軸に蛍光強度、横軸にＰＣＲサイクル数を示す。図３Ａは組織由来のＤＮＡ溶液、図３Ｂは飼育水由来のＤＮＡ溶液の定量ＰＣＲの結果を示す。
環境Ａ及び環境Ｂから採取した環境ＤＮＡの定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。縦軸に蛍光強度、横軸にＰＣＲサイクル数を示す。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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