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公開番号2025105635
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-07-10
出願番号2025067242,2023191978
出願日2025-04-16,2016-03-25
発明の名称生物学的汚染物質を検出するための組成物および方法
出願人リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド,REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/6876 20180101AFI20250703BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】微生物汚染物質が生物学的治療用物質生産プロセスに存在するかどうかについての判定に有用な組成物および方法を提供する。
【解決手段】偽陽性結果の迅速かつリアルタイムの検出を可能にする、人工の陽性増幅対照プラスミドおよび一意的定量PCR検出プローブが提供される。人工ヌクレオチド配列、フルオロフォア、およびクエンチャーを含む組成物であって、該人工ヌクレオチド配列が、その3'末端に、ある配列群の中のいずれか1つの配列と同一である連続した5個以下の核酸を含む、組成物が提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
人工ヌクレオチド配列、フルオロフォア、およびクエンチャーを含む組成物であって、該人工ヌクレオチド配列が、その3'末端に、SEQ ID NO:9および12～37のいずれか1つの配列と同一である連続した5個以下の核酸を含む、組成物。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
フルオロフォアが、495nm以上680nm以下の範囲内の励起波長、および515nm以上710nm以下の範囲内の発光波長を有するフルオロフォアの群より選択される、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
クエンチャーが、430nm以上672nm以下の範囲内に吸収のピークを有する色素の群より選択される、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
フルオロフォアが、495nmの励起波長および520nmの発光波長を有する、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
フルオロフォアがFAMである、請求項4記載の組成物。
【請求項６】
クエンチャーがBHQ-1である、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
フルオロフォアが人工ヌクレオチド配列の5'末端に結合しており、かつクエンチャーが人工ヌクレオチド配列の3'末端に結合している、請求項1記載の組成物。
【請求項８】
人工ヌクレオチド配列が、
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の核酸配列を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項９】
a．齧歯類パルボウイルス特異的順方向オリゴヌクレオチドプライマー；
b．齧歯類パルボウイルス特異的オリゴヌクレオチド検出プローブ；
c．人工オリゴヌクレオチド検出プローブ；
d．齧歯類パルボウイルス特異的逆方向オリゴヌクレオチドプライマー；
e．M13特異的順方向オリゴヌクレオチドプライマー；
f．M13特異的オリゴヌクレオチド検出プローブ；および
g．M13特異的逆方向オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、組成物。
【請求項１０】
a、b、およびdのオリゴヌクレオチド配列がそれぞれ、マウスの微小ウイルスプロトタイプ系統（MVMp）、マウスの微小ウイルス免疫抑制系統（MVMi）、マウスの微小ウイルスCutter系統（MVMc）、マウスパルボウイルス1b（MPV-1b）、マウスパルボウイルス1a（MPV-1a）、マウスパルボウイルス1c（MPV-1c）、ハムスターパルボウイルス（HaPV）、Toolanのパルボウイルス（H-1）、Kilhamラットウイルス（KRV）、ラットパルボウイルス1a、ラット微小ウイルス、およびラットウイルスLのUmass系統（RV-Umass）からなる群より選択される齧歯類パルボウイルスのNS-1配列を含む、請求項9記載の組成物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条（e）の下で、2015年3月27日に提出された米国仮特許出願第62/139,321号の優先権の恩典を主張するものであり、その出願は参照によりその全体が本明細書に具体的に組み入れられる。
続きを表示（約 3,700 文字）【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、細胞培養により生物学的分子を製造するプロセスに関する。本発明は、より具体的には、しかしながら排他的にではなく、細胞培養物における生物学的汚染物質を検出するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
バイオ医薬品、とりわけ治療用抗体は、哺乳動物細胞培養物によって生産される。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞は、最もよく用いられる宿主細胞である。これらの生産系は、外来性および内因性のウイルス感染を起こしやすく、それは、バイオ医薬品に関する潜在的な安全性の問題を提示する。したがって、薬物の安全性を向上させるために、ウイルスクリアランス手順およびウイルス量測定が用いられる。ウイルス量を低下させるために採用されるステップには、ナノ濾過、熱またはpHの保持によるウイルス不活性化、およびクロマトグラフィーが含まれる。ウイルス量、およびウイルス除去効果は、時間のかかる感染性アッセイによって、またはリアルタイムPCRもしくは定量ポリメラーゼ連鎖反応（Q-PCR）などの迅速な定量アッセイによってモニターされ得る。
【０００４】
Q-PCRは、適正な陰性および陽性対照が信頼できるものであることを必要とする。適正な核酸抽出のための管理のために、核酸抽出対照を試験サンプルに追加する。核酸抽出対照が陰性であるまたはQ-PCRの間に予想される回収範囲外にある場合には、サンプルは却下される。逆に、核酸抽出対照が陽性であるまたはQ-PCRの間に予想される回収範囲内にある場合、試験サンプルからの核酸抽出は信頼できると見なされる。サンプル不含バッファーなどの陰性対照が、通常Q-PCRアッセイに含まれる。陰性対照における陽性シグナルの存在は、ウイルス物質によるQ-PCRまたは核酸抽出試薬の汚染を意味し得る。
【０００５】
陽性増殖対照も、Q-PCRウイルス量アッセイに含まれ得る。そのような陽性対照は、本物のウイルス汚染物質を増幅するプライマーを用いて増幅される保存されたウイルス核酸配列を含み得る。Q-PCRが陽性対照を検出することができないことは、ウイルス汚染物質が試験サンプル中に存在した場合に、増幅手順がウイルス汚染物質を検出できていないであろうことを示し得る。
【０００６】
標的汚染物質を模倣する陽性増幅対照の使用は、それ自身の問題を生む。ほんのわずかな量であっても試験サンプルが陽性対照で汚染されている場合、Q-PCRの優れた感度を考慮すると、試験サンプルは偽陽性を示し得る。低レベルの陽性増幅対照を用いる、陽性対照作業のために隔離室を用いる、dUTPを含有するPCR産物を選択的に分解するUNG/dUTPシステムを用いる、単回使用の容器およびディスプレイスメント式ピペットを用いることによって、ならびに作業エリアおよび設備を徹底的に浄化することによって、偽陽性は、ある程度軽減することが可能である。それらの軽減策の細心の使用にもかかわらず、偽陽性の結果はPCR試験中になおも生じる。
【０００７】
バイオ医薬品製造において、生物学的汚染物質に対して偽陽性が出るリスクは無視できず、かつ結果として費用のかかる是正措置の原因となり得る。所与の陽性PCR結果が真陽性であるのか、または陽性対照の交差汚染により生じる偽陽性であるのかを判定するシステムおよび方法の大きな必要性がある。本出願者らは、偽陽性Q-PCRシグナルのリアルタイム判定を可能にする陽性対照組成物、システム、および方法を開発しておりかつここで開示する。
【発明の概要】
【０００８】
本出願者らは、試験サンプルにおける標的汚染物質に対する陽性のQ-PCRシグナルが真陽性であるのか、または交差汚染による偽陽性であるのかをリアルタイムで同定するという課題を解決した。本出願者らは、生物学的汚染物質標的配列（すなわち、陽性対照配列）および一意的人工プラスミド特異的配列を含む、陽性増幅対照（PAC）プラスミドを作り出した。この一意的人工プラスミド特異的配列は、それがサンプル中にある場合、アッセイ技術者がプラスミドを特異的に同定するのを可能にする。ゆえに、陽性の汚染物質シグナルが検出され、かつ人工プラスミド特異的配列が存在しないと判定された場合、技術者は、結果が真陽性の結果であることを確信し得る。逆に、偽陽性の事象において、一意的人工プラスミド配列の存在により、技術者は、表向きの陽性結果を偽陽性として迅速に排除することが可能となる。
【０００９】
一部の態様において、陽性対照の一意的人工プラスミド特異的配列（「一意的配列」；別名、PACPまたは陽性増殖対照ポリヌクレオチド）は、Q-PCR反応混合物に含まれる蛍光標識された人工オリゴヌクレオチド検出プローブ（「一意的検出プローブ」または「UDP」）を用いて検出される。一意的検出プローブは、フルオロフォアおよびクエンチャーに共有結合した核酸ポリマーを含む。「一意的」核酸ポリマーは、一意的配列に特異的にアニールして、PCR中に一意的配列のアンプリコンコピーに取り込まれるように設計される。「一意的」核酸ポリマーは、対象アッセイの実施において採用されるハイブリダイゼーション条件下で、天然に存在するいかなるパルボウイルスも認識せずアニールもしないように設計される。一態様において、「一意的」核酸ポリマーは17～20個のヌクレオチドを含み、ここで、連続した7～10個以下の内部ヌクレオチドおよび連続した6個以下の3'ヌクレオチドは任意のパルボウイルス配列と同一である。一態様において、「一意的」ヌクレオチドポリマーは17～20個のヌクレオチドを含み、ここで、連続した7～10個以下のヌクレオチドおよび連続した6個以下の3'ヌクレオチドは、SEQ ID NO:9および12～37に明示される任意のパルボウイルス配列と同一である。一意的検出プローブの核酸ポリマーがアンプリコンコピーに組み入れられなかった場合、クエンチャーはフルオロフォアの近くに近接したままである。フルオロフォアが励起されたならば、クエンチャーは、放たれた光を吸収しかつその光が検出されるのを阻止する（FRETまたは接触クエンチングによる）。核酸ポリマーがアンプリコンコピーに組み入れられた場合（すなわち、一意的配列がサンプル中に存在する場合）、フルオロフォアおよびクエンチャーは一意的検出プローブから放出され、したがって空間的に分離される。この場合、フルオロフォアが励起された時、クエンチャーは十分に遠く離れていることから、放たれた光を効率的にクエンチングすることができない。したがって、放たれた光は検出され得る。ゆえに、一意的配列がサンプル中に存在する場合、検出可能な発光波長は、PCRが進むにつれて強度を増加させる。一意的配列が不在である場合、クエンチャーはその機能を果たし、かつPCRが進展しても発光波長は検出されない。一態様において、フルオロフォアは核酸ポリマーの5'末端にまたはその付近に、かつクエンチャーは3'末端にまたはその付近に結合されている。代替的な態様において、フルオロフォアは核酸ポリマーの3'末端にまたはその付近に、かつクエンチャーは5'末端にまたはその付近に結合されている。
【００１０】
現在公知であるまたは後に発見される任意のフルオロフォア-クエンチャーペアが、本発明の実践において用いられ得る。（例えば、S.A. Marras,「Selection of fluorophore and quencher pairs for fluorescent nucleic acid hybridization probes」, Methods Mol. Biol. 2006; 335:3-16を参照されたい。）一部の態様において、フルオロフォアは、それぞれ、495nm、538nm、または646nmの励起波長、および520nm、554nm、または669nmの発光波長を有する。一部の態様において、クエンチャーは、430nm～672nmの吸収ピークを有する色素である。一部の態様において、クエンチャーは、DDQ-I、Dabcyl、Eclipse、Iowa Black FQ、BHQ-1、QSY-7、BHQ-2、DDQ-II、Iowa Black RQ、QSY-21、およびDHQ-3からなる群より選択される。一態様において、フルオロフォアは、495nmの励起波長および520nmの発光波長を有し（例えばFAM）、かつクエンチャーはBHQ-1である。一態様において、核酸ポリマーは、
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4
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の核酸配列を含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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