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公開番号2025092572
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-19
出願番号2025052613,2023113055
出願日2025-03-26,2016-09-09
発明の名称異種移植のための多トランスジェニックブタ
出願人レビビコア, インコーポレイテッド
代理人個人,個人
主分類A01K 67/0275 20240101AFI20250612BHJP(農業;林業;畜産;狩猟;捕獲;漁業)
要約【課題】改善された機能性を有する肺異種移植片を提供することができるドナー動物を提供する。
【解決手段】本発明は、それらの動物を異種移植に適するドナーに都合よくさせる複数の遺伝子改変を含む、トランスジェニック動物(例えば、トランスジェニックブタ動物)を対象とする。本発明は、これらの動物に由来する器官、器官断片、組織および細胞、ならびにそれらの治療的使用に拡張する。本発明は、そのような動物を作製する方法にさらに拡張する。第1の態様では、本発明は、少なくとも2つのプロモーターの制御下で単一の遺伝子座において組み込まれ、発現される、少なくとも4つの導入遺伝子を含むトランスジェニックブタであって、アルファ1,3ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を欠くトランスジェニックブタを提供する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
少なくとも４つの導入遺伝子を含むトランスジェニックブタであって、
（ｉ）前記少なくとも４つの導入遺伝子が、少なくとも２つのプロモーターの制御下で単一の遺伝子座において組み込まれ、発現される；
（ｉｉ）前記単一の遺伝子座が、ＣＭＡＨ、β４ＧａｌＮＴ２およびＧＧＴＡ１からなる群より選択される天然または改変された遺伝子座である；
（ｉｉｉ）前記トランスジェニックブタが、アルファ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの発現を欠く；かつ
（ｉｖ）前記少なくとも４つの導入遺伝子のうちの２つが、第１のプロモーターによって制御される第１のポリシストロンとして発現され、前記４つの導入遺伝子のうちの２つが、前記第１のプロモーターとは異なる第２のプロモーターによって制御される第２のポリシストロンとして発現され；そして
（ａ）前記第１のポリシストロンがＴＢＭとＣＤ３９を含み；前記第２のポリシストロンがＥＰＣＲとＤＡＦ（ＣＤ５５）；ＴＦＰＩとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＨＯ－１；ＣＤ４７とＨＯ－１；Ａ２０とＣＤ４７；ＣＩＩＴＡＫＤとＨＯ－１；ＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤとＡ２０；ＣＩＩＴＡＫＤとＴＦＰＩ；ＥＰＣＲとＴＦＰＩ；または、ＣＩＩＴＡとＴＦＰＩを含む；
（ｂ）前記第１のポリシストロンがＥＰＣＲとＤＡＦ（ＣＤ５５）を含み；前記第２のポリシストロンがＴＢＭとＣＤ３９；ＴＦＰＩとＣＤ４７；ＴＢＭとＣＤ４７；ＴＢＭとＴＦＰＩ；ＴＢＭとＨＯ－１；ＣＤ４７とＨＯ－１；Ａ２０とＣＤ４７；ＣＩＩＴＡＫＤとＨＯ－１；ＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤとＡ２０；ＴＢＭとＡ２０；ＣＩＩＴＡＫＤとＴＦＰＩ；または、ＣＩＩＴＡとＴＦＰＩを含む；
（ｃ）前記第１のポリシストロンがＴＦＰＩとＣＤ４７を含み；前記第２のポリシストロンがＴＢＭとＣＤ３９；ＥＰＣＲとＤＡＦ（ＣＤ５５）；ＥＰＣＲとＨＯ－１；ＴＢＭとＨＯ－１；ＴＢＭとＥＰＣＲ；ＣＩＩＴＡＫＤとＨＯ－１；ＣＩＩＴＡＫＤとＡ２０；または、ＴＢＭとＡ２０を含む；
（ｄ）前記第１のポリシストロンがＴＢＭとＣＤ４７を含み；前記第２のポリシストロンがＥＰＣＲとＤＡＦ（ＣＤ５５）；ＥＰＣＲとＨＯ－１；ＣＩＩＴＡＫＤとＨＯ－１；ＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤとＡ２０；ＣＩＩＴＡＫＤとＴＦＰＩ；ＥＰＣＲとＴＦＰＩ；または、ＣＩＩＴＡとＴＦＰＩを含む；
（ｅ）前記第１のポリシストロンがＥＰＣＲとＣＤ４７を含み；前記第２のポリシストロンがＴＢＭとＣＤ３９；ＴＢＭとＴＦＰＩ；ＴＢＭとＨＯ－１；ＣＩＩＴＡＫＤとＨＯ－１；ＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤとＡ２０；ＴＢＭとＡ２０；ＣＩＩＴＡＫＤとＴＦＰＩ；または、ＣＩＩＴＡとＴＦＰＩを含む；
（ｆ）前記第１のポリシストロンがＴＢＭとＴＦＰＩを含み；前記第２のポリシストロンがＥＰＣＲとＤＡＦ（ＣＤ５５）；ＥＰＣＲとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＨＯ－１；ＣＤ４７とＨＯ－１；Ａ２０とＣＤ４７；ＣＩＩＴＡＫＤとＨＯ－１；または、ＣＩＩＴＡＫＤとＡ２０を含む；
（ｇ）前記第１のポリシストロンがＥＰＣＲとＨＯ－１を含み；前記第２のポリシストロンがＴＢＭとＣＤ３９；ＴＦＰＩとＣＤ４７；ＴＢＭとＣＤ４７；ＴＢＭとＴＦＰＩ；ＴＦＰＩとＣＤ４７；Ａ２０とＣＤ４７；ＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤとＡ２０；ＴＢＭとＡ２０；ＣＩＩＴＡＫＤとＴＦＰＩ；または、ＣＩＩＴＡとＴＦＰＩを含む；
（ｈ）前記第１のポリシストロンがＴＢＭとＨＯ－１を含み；前記第２のポリシストロンがＥＰＣＲとＤＡＦ（ＣＤ５５）；ＴＦＰＩとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＣＤ４７；ＴＦＰＩとＣＤ４７；Ａ２０とＣＤ４７；ＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤとＡ２０；ＣＩＩＴＡＫＤとＴＦＰＩ；ＥＰＣＲとＴＦＰＩ；または、ＣＩＩＴＡとＴＦＰＩを含む；
（ｉ）前記第１のポリシストロンがＣＤ４７とＨＯ－１を含み；前記第２のポリシストロンがＴＢＭとＣＤ３９；ＥＰＣＲとＤＡＦ（ＣＤ５５）；ＴＢＭとＴＦＰＩ；ＴＢＭとＥＰＣＲ；ＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤとＡ２０；ＴＢＭとＡ２０；ＣＩＩＴＡＫＤとＴＦＰＩ；ＥＰＣＲとＴＦＰＩ；または、ＣＩＩＴＡとＴＦＰＩを含む；
（ｊ）前記第１のポリシストロンがＴＢＭとＥＰＣＲを含み；前記第２のポリシストロンがＴＦＰＩとＣＤ４７；ＣＤ４７とＨＯ－１；ＴＦＰＩとＣＤ４７；Ａ２０とＣＤ４７；ＣＩＩＴＡＫＤとＨＯ－１；ＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤとＡ２０；ＣＩＩＴＡＫＤとＴＦＰＩ；または、ＣＩＩＴＡとＴＦＰＩを含む；
（ｋ）前記第１のポリシストロンがＡ２０とＣＤ４７を含み；前記第２のポリシストロンがＴＢＭとＣＤ３９；ＥＰＣＲとＤＡＦ（ＣＤ５５）；ＴＢＭとＴＦＰＩ；ＥＰＣＲとＨＯ－１；ＴＢＭとＨＯ－１；ＴＢＭとＥＰＣＲ；ＣＩＩＴＡＫＤとＨＯ－１；ＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤとＴＦＰＩ；ＥＰＣＲとＴＦＰＩ；または、ＣＩＩＴＡとＴＦＰＩを含む；
（ｌ）前記第１のポリシストロンがＣＩＩＴＡＫＤとＨＯ－１を含み；前記第２のポリシストロンがＴＢＭとＣＤ３９；ＥＰＣＲとＤＡＦ（ＣＤ５５）；ＴＦＰＩとＣＤ４７；ＴＢＭとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＣＤ４７；ＴＢＭとＴＦＰＩ；ＴＦＰＩとＣＤ４７；ＴＢＭとＥＰＣＲ；Ａ２０とＣＤ４７；ＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩ；ＴＢＭとＡ２０；ＥＰＣＲとＴＦＰＩ；または、ＣＩＩＴＡとＴＦＰＩを含む；
（ｍ）前記第１のポリシストロンがＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩを含み；前記第２のポリシストロンがＴＢＭとＣＤ３９；ＥＰＣＲとＤＡＦ（ＣＤ５５）；ＴＢＭとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＨＯ－１；ＴＢＭとＨＯ－１；ＣＤ４７とＨＯ－１；ＴＢＭとＥＰＣＲ；Ａ２０とＣＤ４７；ＣＩＩＴＡＫＤとＨＯ－１；ＣＩＩＴＡＫＤとＡ２０；または、ＴＢＭとＡ２０を含む；
（ｎ）前記第１のポリシストロンがＣＩＩＴＡＫＤとＡ２０を含み；前記第２のポリシストロンがＴＢＭとＣＤ３９；ＥＰＣＲとＤＡＦ（ＣＤ５５）；ＴＦＰＩとＣＤ４７；ＴＢＭとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＣＤ４７；ＴＢＭとＴＦＰＩ；ＥＰＣＲとＨＯ－１；ＴＢＭとＨＯ－１；ＣＤ４７とＨＯ－１；ＴＦＰＩとＣＤ４７；ＴＢＭとＥＰＣＲ；ＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩ；ＥＰＣＲとＴＦＰＩ；または、ＣＩＩＴＡとＴＦＰＩを含む；
（ｏ）前記第１のポリシストロンがＴＢＭとＡ２０を含み；前記第２のポリシストロンがＥＰＣＲとＤＡＦ（ＣＤ５５）；ＴＦＰＩとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＨＯ－１；ＣＤ４７とＨＯ－１；ＴＦＰＩとＣＤ４７；ＣＩＩＴＡＫＤとＨＯ－１；ＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤとＴＦＰＩ；ＥＰＣＲとＴＦＰＩ；または、ＣＩＩＴＡとＴＦＰＩを含む；
（ｐ）前記第１のポリシストロンがＣＩＩＴＡＫＤとＴＦＰＩを含み；前記第２のポリシストロンがＴＢＭとＣＤ３９；ＥＰＣＲとＤＡＦ（ＣＤ５５）；ＴＢＭとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＨＯ－１；ＴＢＭとＨＯ－１；ＣＤ４７とＨＯ－１；ＴＢＭとＥＰＣＲ；Ａ２０とＣＤ４７；ＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩ；または、ＴＢＭとＡ２０を含む；
（ｑ）前記第１のポリシストロンがＥＰＣＲとＴＦＰＩを含み；前記第２のポリシストロンがＴＢＭとＣＤ３９；ＴＢＭとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＣＤ４７；ＴＢＭとＨＯ－１；ＣＤ４７とＨＯ－１；Ａ２０とＣＤ４７；ＣＩＩＴＡＫＤとＨＯ－１；ＣＴＬＡ４ＩｇとＴＦＰＩ；ＣＩＩＴＡＫＤとＡ２０；または、ＴＢＭとＡ２０を含む；あるいは
（ｒ）前記第１のポリシストロンがＣＩＩＴＡとＴＦＰＩを含み；前記第２のポリシストロンがＴＢＭとＣＤ３９；ＥＰＣＲとＤＡＦ（ＣＤ５５）；ＴＢＭとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＣＤ４７；ＥＰＣＲとＨＯ－１；ＴＢＭとＨＯ－１；ＣＤ４７とＨＯ－１；ＴＢＭとＥＰＣＲ；Ａ２０とＣＤ４７；ＣＩＩＴＡＫＤとＨＯ－１；ＣＩＩＴＡＫＤとＡ２０；または、ＴＢＭとＡ２０を含む、
トランスジェニックブタ。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／２１６，２２５号および２０１５年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２５６，０６８号の利益を主張し、これらの内容は、その全体が本明細書において参考として援用される。
続きを表示（約 2,500 文字）【背景技術】
【０００２】
ブタは多くの解剖学的および生理的特徴をヒトと共有するので、ブタは異種移植のほとんどの研究の焦点であった。またブタは妊娠期間が比較的短く、無菌環境で飼育することができ、食物供与源として一般的に使用されない動物（例えば、霊長類）と関連する同じ倫理的問題を起こす可能性がない。ブタから霊長類への異種移植の分野における科学的知識および専門知識は過去１０年にわたって急速に増殖し、救命ブタ異種移植片の霊長類レシピエントのかなり長期の生存をもたらした。（Cozziら、Xenotransplantation、１６巻：２０３～２１４頁。２００９年）。最近、器官異種移植の分野においてかなりの達成が報告されている。（Ekserら、２００９年、Transplant Immunology Jun、２１巻（２号）：８７～９２頁）。
【０００３】
前臨床モデルにおいてブタ器官の使用への生物学的障壁を克服するために、かなりの進歩が見られ、一部の心腎系で器官機能の持続およびレシピエントの生存が数カ月から数年まで到達している（Mohiuddin MMら、Am J Transplant、２０１４年；１４巻：４８８～４８９頁；Iwase Hら、Xenotransplantation、２０１５年；２２巻：３０２～３０９
頁。Higginbotham Lら、Xenotransplantation、２０１５年；２２巻：２２１～２３０頁）。しかし、今日までの進歩は心腎に関してはかなりのものであるが、ヒトに転用されるレベルにはまだ到達していない。さらに、肺などの他の器官は、さらにより大きな課題となっている。例えば、生命維持肺異種移植片生存は、霊長類では数日に限定されている（Lairdら、２０１６年６月、www.cotransplantation.com、２１巻３号）。
【０００４】
肺移植は、進行期の肺疾患のために容認された処置である。１９６３年に最初に実行され、それ以来、３２，０００件を超える肺移植が世界中で実行された。大多数の方法は死体移植であり、ドナーの肺は脳死状態であるがなお生命維持状態である患者から得られる。死体ドナー肺の数の限界は、１９９０年代に生体ドナー肺葉肺移植（ＬＤＬＬＴ）の発達につながり、２人またはそれより多くの生体患者が肺のセグメント（肺葉）を提供する。しかし、ドナープールは比較的乏しいままであり、移植の長期転帰は免疫抑制レジメンによって妨げられたままである。
【０００５】
異種移植（異なる種のドナーからの器官、組織および細胞の移植）は、ヒトドナーの肺の不足に効果的に対処できるかもしれない。好都合にも、異種移植片は、（ｉ）予測可能に、非緊急的に供給される；（ｉｉ）制御環境において生産される；ならびに（ｉｉｉ）移植前の特徴付けおよび研究で利用可能である。しかし、他の器官と比較して、肺胞上皮と緊密に関連した血管内皮の大きな表面積ならびに強健な免疫監視および迅速な応答系を有する肺の特異な解剖学的構造は、前もって炎症を誘発するようになっており、その結果の影響を極めて受けやすい（den Hengst WAら、Am J Physiol Heart Circ Physiol、２０１０年；２９９巻：Ｈ１２８３～Ｈ１２８９頁；Ranieri VMら、JAMA１９９９年；２８２巻：５４～６１頁）。
【０００６】
多くの点で有利であるが、異種移植は同種移植より複雑な免疫学的シナリオを形成する。ブタから霊長類への異種移植で最も重大な障壁は、３つの相：超急性拒絶反応（ＨＡＲ）、急性体液性異種移植片拒絶反応（ＡＨＸＲ）およびＴ細胞媒介細胞性拒絶反応に分けられる免疫機構のカスケードによる移植された器官の拒絶反応である。ＨＡＲは、移植片再灌流の後の数分から数時間以内に不可逆的な移植片損傷および喪失をもたらす非常に急速な事象である。
【０００７】
ドナー動物の遺伝子改変を通して、異種移植によってもたらされる免疫障壁に対処することにかなりの努力が向けられた。アルファ－１，３－Ｇａｌエピトープ（ブタから霊長類への異種移植片のＨＡＲを誘発する主要な異種抗原）を欠く遺伝子改変ブタは、他の拒絶反応機構およびブタと霊長類の血液凝固系の間の不適合性に対処することができるさらなる遺伝子改変のための基礎であると考えられる。異種移植の成功のためにおそらく複数の遺伝子改変が必要であるが、それらは生産関連の課題を含む課題を提起する。複数の免疫調節導入遺伝子を安定して発現するトランスジェニックブタの生成が、異種移植片拒絶反応を克服することに必須であることは明白である。
【０００８】
単一の導入遺伝子を含有するブタの伝統的な交配による多トランスジェニックブタの生成がこれまで利用され、多くの成功を収めてきた（Ekserら、２００９年、Transplant Immunology Jun ２１巻（２号）：８７～９２頁；Lairdら、２０１６年６月、www.cotransplantation.com、２１巻３号）。しかし、交配は時間がかかり、高価であり、導入遺伝子の一貫した発現レベルがやがて問題になる可能性がある。
【０００９】
最近、様々な細胞型および動物に複数の導入遺伝子を挿入するために、ポリシストロン性発現系の使用が開発された。これらの系を使用して多トランスジェニックブタを生成することの実現可能性が示唆された。
【００１０】
Dengら（PLOS ONE、www.plosone.org、２０１１年５月、６巻、５号、ｅ１９９８６頁）は、２Ａペプチド二シストロン系および導入遺伝子のランダム組み入れを通した核移植を使用して、４つの蛍光性タンパク質を発現するトランスジェニックブタを生産した。
（【００１１】以降は省略されています）

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