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公開番号2024165150
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-28
出願番号2023081056
出願日2023-05-16
発明の名称SARS-CoV-2中和抗体
出願人花王株式会社,株式会社Epsilon Molecular Engineering,学校法人北里研究所
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類C12N 15/13 20060101AFI20241121BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】SARS-CoV-2及びその変異株に対して幅広く結合活性及び中和活性を示すシングルドメイン抗体及びその利用法を提供する。
【解決手段】下記(a)又は(b)で示されるエピトープに結合する抗SARS-CoV-2モノクローナル抗体。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列の33番目のチロシンから43番目のシステインまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ、及び配列番号1で示されるアミノ酸配列の124番目のアスパラギン酸から137番目のロイシンまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列の51番目のチロシンから56番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ及び178番目のグリシンから194番目のバリンまでの領域又はこれに相当する領域に含まれるエピトープ
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３番目のチロシンから４３番目のシステインまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の１２４番目のアスパラギン酸から１３７番目のロイシンまでの領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５１番目のチロシンから５６番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸領域又はこれに相当するアミノ酸領域に含まれるエピトープ及び１７８番目のグリシンから１９４番目のバリンまでの領域又はこれに相当する領域に含まれるエピトープ
続きを表示（約 640 文字）【請求項２】
前記（ａ）で示されるエピトープに結合する抗体が、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗体が、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
単一ドメイン抗体、少なくとも1つの当該単一ドメイン抗体を含む単一ドメイン抗体多量体、又は少なくとも１つの当該単一ドメイン抗体と他の分子を連結させた抗体のいずれかである、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
前記単一ドメイン抗体がヒト化された特徴を有する、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１～５のいずれか１項記載の抗体をコードする核酸。
【請求項７】
請求項１～５のいずれか１項記載の抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療薬。
【請求項８】
前記（ａ）で示されるエピトープに結合する抗体と前記（ｂ）で示されるエピトープに結合する抗体を組み合わせてなる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療薬。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する抗体に関する。
続きを表示（約 3,700 文字）【背景技術】
【０００２】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｓｅｖｅｒｅａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ２）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶやＭＥＲＳ－ＣｏＶと同様ベータコロナウイルス属に属し、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となるＳＡＲＳ関連コロナウイルスである。２０１９年に中国湖北省武漢市付近で発生が初めて確認され、その後、ＣＯＶＩＤ－１９の世界的流行を引き起こしている。
【０００３】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、一般的なコロナウイルスと同様に、４つの構造タンパク質、１６の非構造タンパク質（ｎｓｐ１－１６）、及びいくつかの付属タンパク質をコードする大きなポジティブセンスＲＮＡゲノムを有している。構造タンパク質は、スパイクタンパク質、ヌクレオカプシド、膜タンパク質、エンベロープタンパク質から成り、スパイクタンパク質は、受容体結合を担うＮ末端のＳ１サブユニットと膜融合を担うＣ末端のＳ２サブユニットから構成される。Ｓ１サブユニットはさらに、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、サブドメイン１（ＳＤ１）、サブドメイン２（ＳＤ２）に分割されている。Ｓ２サブユニットは、さらに、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタドリピート１（ＨＲ１）及びヘプタドリピート２（ＨＲ２）に分割されていることが知られている（非特許文献１参照）。
【０００４】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、そのスパイクタンパク質を介して宿主細胞受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と結合して細胞内に侵入する。受容体との結合は、スパイク蛋白質の構造変化を引き金とし、活性化状態へと変化させる。活性化されたスパイクは、Ｓ１／Ｓ２部位でプロテアーゼ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ではＴＭＰＲＳＳ２）によって切断され、Ｓ１サブユニットが放出され、Ｓ２サブユニット上のＦＰが露出する。ＦＰは標的細胞膜に挿入され、ＨＲ１とＨＲ２がリフォールドして融合後のコンフォメーションを形成し、標的細胞とのウイルス膜融合を促進することが知られている（非特許文献２参照）。
【０００５】
低温電子顕微鏡や結晶解析によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２三量体スパイクのプレフュージョンコンフォメーションやＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤと完全長ヒトＡＣＥ２の構造解析が進んでおり、ＡＣＥ２への結合様式の解明やヒトＡＣＥ２とのより強い接触を形成するＲＢＤ上の重要な変異点の知見、更には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤを標的とする交差反応性抗体の同定に向けたエピトープの洞察が提供されている。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク蛋白質の糖鎖解析から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク蛋白質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ同様に多くのグリコシル化部位を有しており、その中でもＳＡＲＳ－ＣｏＶには無い、ユニークなグリコシル化部位も報告されており、この様な特異な糖鎖がエピトープのマスキングを介した免疫回避を促進する可能性があることも報告されている（非特許文献３参照）。
【０００６】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、宿主細胞にウイルスが侵入する際に不可欠な役割を果たしており、中和抗体の主要な標的となる。コロナウイルスＳ１サブユニットの機能性と高い免疫原性のため、これまでにコロナウイルスに対して特徴づけられたほとんどの中和抗体は、Ｓ１サブユニット、特にＲＢＤを標的としていることが報告されている。また、以前のＳＡＲＳ及びＭＥＲＳの感染の流行中にもいくつかの中和抗体が開発され、コロナウイルス感染症の治療での使用の可能性が証明されている。
しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶＲＢＤに特異的な多くの既知の中和抗体（Ｓ２３０、ｍ３９６、８０Ｒなど）は、１μＭまでの濃度でもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合せず、一方で、単一のＢ細胞の選別によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者から単離されたモノクローナル抗体はいずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのＲＢＤと交差反応を示さないことが報告されている。この様に、多くの既存の中和抗体は交差反応性に乏しいが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方に中和活性を示す４７Ｄ１１やＳ３０９といったＩｇＧ抗体やシングルドメイン抗体としてＶＨＨ－７２－Ｆｃ等が存在することも報告されている（非特許文献３参照）。現在までに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を標的とした中和抗体薬が世界各国で承認されている。
【０００７】
ＣＯＶＩＤ－１９はその発生から３年以上経った２０２３年２月現在においても完全な収束には至らず、その原因の１つはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の出現によるものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株では、スパイクタンパク質のアミノ酸配列に様々な変異（アミノ酸の置換、欠損又は挿入）が生じており、従来のウイルス株と比較しての感染力や抗原性の変化が確認されている。国立感染症研究ではこうしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異のリスクを分析し、その評価に応じて、変異株を「懸念される変異株（ＶＯＣ）」と「注目すべき変異株（ＶＯＩ）」と定めている。これまでに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株が世界各地で出現しており、現在ではＶＯＣの１つであるオミクロン株が世界的な流行株として広まっている。さらに、承認されている中和抗体薬の中にはＶＯＣの１つであるオミクロン株に対する中和活性が低下することが報告されている（非特許文献４参照）。そのため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の流行を抑制するためには、既存の変異株だけでなく将来的に出現する新規変異株に対しても有効な中和抗体の開発が重要である。
【０００８】
免疫応答における抗体は、生体が感染によって抗原と接触した後、比較的感染初期に患者の血中で増加するイムノグロブリンＭ（以下、「ＩｇＭ」と略すことがある）と、その後に増加するＩｇＧ等があることが知られている。ここで、一般的なＩｇは軽鎖と重鎖とで構成されているが、ラクダ科の動物は、軽鎖を含まない重鎖抗体を産生することが知られている。また、重鎖抗体の可変領域を含む単一のドメインは、天然のシングルドメインであり、それ自身でも抗体として機能する。このため、「単一ドメイン抗体」（以下、「ＶＨＨ」と略すことがある。）と呼ばれている。
ウイルスの立体構造エピトープが、例えば、酵素ポケットのような穴状の構造や、ドメイン間の割目の構造部分を含む場合、従来のＩｇＧではその大きさからこうしたエピトープに結合することができなかった。これに対し、上記のＶＨＨは、その分子量がＩｇＧ抗体の１０分の１と小さいため、上記のような構造のエピトープにも結合することができ、多くの糖鎖で修飾されたウイルス粒子の表面等にも結合できるため、標的分子になり得る分子の幅が広くなる。
【０００９】
さらに、ＶＨＨは耐酸性や耐熱性にも優れており、ＩｇＧとは異なって培養細胞で産生させる必要がなく、微生物等で生産することができる。このため、量産しやすく、精製も容易であるという利点がある。さらに、ＶＨＨは１本鎖のペプチドで構成されているため、蛋白質工学の技術又は化学修飾等の技術を用いて機能の改変がしやすく、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製しやすいという特徴を有することが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
Neutralizing nanobodies bind SARS-CoV-2 spike RBD and block interaction with ACE2. Nat Struct Mol Biol. 2021;28:326.
Development of multi-specific humanized llama antibodies blocking SARS-CoV-2/ACE2 interaction with high affinity and avidity. Emerging Microbes & Infections 2020;9;1034-1036
Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-Domain Camelid Antibodies. Cell 2020;181:1004-1015.
Efficacy of Antibodies and Antiviral Drugs against Omicron BA.2.12.1, BA.4, and BA.5 Subvariants. N Engl J Med. 2022;387:468-470.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
（【００１１】以降は省略されています）

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