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公開番号2024114012
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-08-23
出願番号2023019356
出願日2023-02-10
発明の名称神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる試薬、およびそれを用いた生体試料の分析方法
出願人国立大学法人神戸大学
代理人個人,個人,個人
主分類C12Q 1/6881 20180101AFI20240816BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】神経芽腫の微小残存病変の評価における正確性を向上できる、新たな神経芽腫のMRDマーカーの組み合わせを利用する試薬及びそれを用いた生体試料の分析方法を提供する。
【解決手段】本発明の試薬は、B4GALNT1、CHRNA3、CRMP1、DBH、PHOX2B、及びTHからなる神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーと、HPRT1及びHMBSからなるレファレンス遺伝子と、を核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアを含み、神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられ、神経芽腫の微小残存病変の評価における正確性を向上できる。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨからなる神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカーと、ＨＰＲＴ１及びＨＭＢＳからなるレファレンス遺伝子と、を核酸増幅法により増幅しうるプライマーペアを含み、神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる試薬。
続きを表示（約 880 文字）【請求項２】
地固め療法終了時以降における神経芽腫患者から採取した生体試料に対して用いられる、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
骨髄検体に対して用いられる、請求項１に記載の試薬。
【請求項４】
前記遺伝子マーカー及び前記レファレンス遺伝子それぞれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるプローブをさらに含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項５】
Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨからなる神経芽腫の微小残存病変の遺伝子マーカー、並びにＨＰＲＴ１及びＨＭＢＳからなるレファレンス遺伝子の、生体試料中における発現量を、請求項１に記載の試薬を用いて核酸増幅法により測定する測定工程と、
前記遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ６に基づく評価値が、健常者における定量値を参照して設定されるカットオフ値以上か否かを評価する評価工程とを含み、
前記発現量が神経芽腫の微小残存病変の発生レベルと相関し、
前記評価工程において、前記評価値が前記カットオフ値以上である場合に、前記生体試料の神経芽腫の微小残存病変を陽性と判定する、生体試料の分析方法。
【請求項６】
前記遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ６に基づく評価値が、前記遺伝子マーカーの発現量Ａ１～Ａ６の各々に対し、コントロールにおける前記遺伝子マーカー各々の発現量の統計学的数値Ｂ１～Ｂ６を加味した重み付けを行うことで、重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６を取得し、さらに、前記重み付き発現量ＡＢ１～ＡＢ６の幾何平均又は総和をとることにより導出される、請求項５に記載の分析方法。
【請求項７】
前記測定工程における前記核酸増幅法がデジタルＰＣＲである、請求項５に記載の生体試料の分析方法。
【請求項８】
前記測定工程において、同一の核酸増幅装置を用いて前記遺伝子マーカー及びレファレンス遺伝子を同時に核酸増幅する、請求項５に記載の生体試料の分析方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経芽腫の微小残存病変を評価するための遺伝子マーカーおよびその使用に関する。より具体的には、本発明は、神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる試薬、およびそれを用いた生体試料の分析方法に関する。
続きを表示（約 2,500 文字）【背景技術】
【０００２】
神経芽腫は、神経堤細胞由来の難治性小児がんであり、小児がんの約１０％を占める。これは、脳腫瘍に次いで高い頻度である。また神経芽腫は、小児がん死亡原因の約１５％を占める。神経芽腫は、５つの予後因子（病期、病理、年齢、ＭＹＣＮ増幅、ＤＮＡプロイディー）を用いて、低・中間・高リスク群に分類されるが、５０％を超える患者が高リスク群に分類される。そして、高リスク群患者の５０％超で再発する。
【０００３】
したがって、神経芽腫の予後改善、特に高リスク群患者の予後改善には、再発の起源と考えられる微小残存病変（ＭＲＤ）を正しく評価することが不可欠である。腫瘍細胞にのみに検出される遺伝子が同定されていない神経芽腫では、正常細胞に比して腫瘍細胞で高発現するいくつかの遺伝子をマーカーとすることで、ＭＲＤの検出が試みられてきた。
【０００４】
本発明者は、単独で神経芽腫の微小残存病変の検出能力が高い遺伝子マーカーとして、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂ及びＴＨを見出し、これら７種の遺伝子マーカーとレファレンス遺伝子ＨＰＲＴ１とを組み合わせることで、偽陰性の抑制と臨床適用性とを両立した神経芽腫の微小残存病変の評価法を開発した（非特許文献１、特許文献１、特許文献２）。
【０００５】
また、神経芽腫のＭＲＤマーカーとしては他にも様々なものが報告されており、例えば、ＣＨＧＡ、ＤＣＸ、ＤＤＣ、ＰＨＯＸ２Ｂ、およびＴＨの５種の遺伝子マーカーであって、Ｂ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、及びＳＤＨＡのレファレンス遺伝子と組み合わせて用いられるもの（非特許文献２）；ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＨ、及びＤＣＸの３種の遺伝子マーカー（非特許文献３）；神経芽腫の治療標的分子ＧＤ２の合成酵素Ｂ４ＧＡＬＮＴ１を利用した、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＣＮＤ１、ＩＳＬ１、ＰＨＯＸ２Ｂの４種の遺伝子マーカー（非特許文献４）、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＨ、及びＥＬＡＶ４の４種の遺伝子マーカー（非特許文献５）、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＴＨ、ＤＤＣの３種の遺伝子マーカー（非特許文献６）、並びに、ＣＨＲＮＡ３、ＤＤＣ、ＧＡＰ４３、ＰＨＯＸ２Ｂ、およびＴＨの５種の遺伝子マーカー（非特許文献７）；神経芽腫のＭＥＳ群固有のＰＯＳＴＮ、ＰＲＲＸ１及びＦＭＯ３の３種の遺伝子マーカー（非特許文献８）；その他遺伝子マーカーＣＨＧＢ、ＳＮＡＰ９１、ＳＴＭＮ２（非特許文献７）ＧＡＢＲＢ３、ＫＩＦ１Ａ（非特許文献９）ＳＴ８ＳＩＡ２（非特許文献１０）、ＵＣＨＬ１（非特許文献１１）等が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
J Mol Diagn 22: 236-246, 2020.
Clin Cancer Res 23: 5374-5383, 2017.
J Pathol 216: 245-252, 2008.
J Clin Oncol 33: 755-763, 2015.
Pediatr Blood Cancer 369: e27354, 2018.
Int J Cancer 123: 2849-2855, 2008.
Clin Chem 55: 1316-1326, 2009.
JCO Precision Oncology 3: 1-11, 2019.
Clin Cancer Res 14: 7020-7027, 2008.
Int J Cancer 119: 152-156, 2006.
Clin Cancer Res 6: 551-558, 2000.
【特許文献】
【０００７】
国際公開第２０１８／１２３７６４号
国際公開第２０２１／００６３４５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者によってすでに見出された７種の遺伝子マーカーは、それら自体単独で神経芽腫の微小残存病変の検出能力が高い遺伝子マーカーが選択されているが、複数の遺伝子マーカーを組合せることによる性能については検討の余地がある。神経芽腫のＭＲＤマーカーとしては様々なものが報告されているため、検査効率を度外視するならば、組み合わせるマーカーの数を単に増やせばよい。しかしながら、実臨床への適用性を考慮した検査効率を確保しつつ、より一層正確性を改善するためには、新たな神経芽腫のＭＲＤマーカーの組み合わせが要される。
【０００９】
そこで、本発明は、神経芽腫の微小残存病変の評価における正確性を向上できる、新たな神経芽腫のＭＲＤマーカーの組み合わせを利用する試薬及びそれを用いた生体試料の分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、レファレンス遺伝子として特定の２種（つまり、ＨＰＲＴ１及びＨＭＢＳ）を選択する一方で、独自に絞り込んだ２０種の神経芽腫のＭＲＤ遺伝子マーカーからなる一次候補を、独自に選択した検体での発現量に応じて１４種の遺伝子マーカーからなる二次候補に絞り込み、さらに、独自に定めた４つの条件を満たす３通りの遺伝子マーカーの組み合わせに絞り込み、最後に、これらの中から正確性の高い６種からなる遺伝子マーカーの組み合わせ（つまり、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、ＣＨＲＮＡ３、ＣＲＭＰ１、ＤＢＨ、ＰＨＯＸ２Ｂ、及びＴＨ）を選択した。さらに、これら６種の神経芽腫のＭＲＤの遺伝子マーカーと、２種のレファレンス遺伝子とを組み合わせて用いることで、当該技術分野の技術水準からはおおよそ期待し得なかったほどの高い正確性をもって神経芽腫の微小残存病変を評価できることを、予期せず見出した。本発明は、この知見に基づいて、さらに検討を重ねることにより完成したものである。
（【００１１】以降は省略されています）

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