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公開番号2024050211
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-04-10
出願番号2022156921
出願日2022-09-29
発明の名称液状試料の簡易的な前処理方法
出願人東洋紡株式会社
代理人弁理士法人三枝国際特許事務所
主分類C12N 15/10 20060101AFI20240403BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】核酸精製することなく、液状試料中に含まれる微生物由来の核酸を検出する方法を提供すること。
【解決手段】微生物の検出方法に供される液状試料の前処理方法であって、以下の工程A～C:
(A)液状試料に遠心操作を行い、遠心後の沈降物を回収する工程、
(B)前記工程Aで得られた沈降物に水又はアルカリ性溶液を添加する工程、及び
(C)前記工程Bで得られた液を1～20秒間撹拌する工程、
を包含する、方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
微生物の検出方法に供される液状試料の前処理方法であって、以下の工程Ａ～Ｃ：
（Ａ）液状試料に遠心操作を行い、遠心後の沈降物を回収する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた沈降物に水又はアルカリ性溶液を添加する工程、及び
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた液を１～２０秒間撹拌する工程、
を包含する、方法。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
液状試料が、尿、唾液、鼻咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、喀痰懸濁液、及び液状輸送培地に懸濁されたスワブ検体からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程Ｂにおいて、アルカリ性溶液が、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程Ｂにおいて、アルカリ性溶液のｐＨが８．０以上である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記工程Ｃにおいて撹拌する工程が、ボルテックスミキサーによる撹拌処理を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
微生物の検出方法が、微生物由来の核酸を検出する方法である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
検出対象微生物が、クロストリジウム・ディフィシル、赤痢菌、サルモネラ菌、大腸菌、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、結核菌群、非結核性抗酸菌、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、ヒトメタニューモウイルス、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、パラ百日咳菌、肺炎クラミジア、クラミジア・トラコマチス、ナイセリア・ゴノレア、トリコモナス原虫、マイコプラズマ・ジェニタリウム、オウム病クラミジア、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
更に以下の工程Ｄを包含する、請求項１又は２に記載の方法：
（Ｄ）前記工程Ｃで得られた撹拌処理液を精製する工程。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の工程Ｃで得られた撹拌処理液を検出対象試料液とする微生物の検出方法。
【請求項１０】
微生物の検出方法に供される検出対象試料液の調製方法であって、
以下の工程Ａ～Ｃ：
（Ａ）液状試料に遠心操作を行い、遠心後の沈降物を回収する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた沈降物に水又はアルカリ性溶液を添加する工程、及び
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた液を１～２０秒間撹拌する工程、
を包含する、方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、液状試料中に含まれる微生物を検出するための、液状試料の前処理方法、試薬、キット等に関する。
続きを表示（約 3,400 文字）【背景技術】
【０００２】
試料中に含まれる微生物を検出することは臨床診断、食品衛生などにおいて重要である。しかしながら、試料を直接検出に供すると核酸検出中に反応阻害などが起こり、正しい測定結果が得られないことがある。この点はとりわけ、夾雑物を多く含む生体試料（例えば、唾液、尿検体、液状輸送培地に懸濁されたスワブ検体等の液状試料）を対象として微生物を検出する方法において大きな問題である。そこで、試料中に含まれる微生物を検出する際に、試料を直接検出に供するのではなく、何らかの前処理を行うことが一般的である。これは、試料中に含まれる夾雑物の除去や測定に供するための標識作業などを目的としており、試料中の微生物検出のために必要な操作と考えられている。
【０００３】
特に、微生物を検出する方法が微生物由来の核酸を検出する方法である場合、前処理として、試料中の核酸を精製することが一般的に行われる（例えば、特許文献１、非特許文献１）。精製は、核酸を検出するために、例えば、ＰＣＲなどの核酸増幅反応に供する場合、試料中の夾雑物により反応が阻害されることを抑制するために行われている。精製法の一つとして核酸抽出法（例えばＢＯＯＭ法を原理とした方法等）がある。
【０００４】
しかしながら、核酸精製は、操作が非常に複雑、操作時間が長い、有機溶媒を使用する、試薬コストが高い等の課題があった。特に、核酸抽出は操作が煩雑であるとともに、タンパク質変性作用がある毒性の高い試薬を必要とすることがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
特開２０１６－６７２９１号公報
【非特許文献】
【０００６】
R. Boom et al, Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids, Journal of Clinical Microbiology, 1990, vol.28, no.3, p.495-503.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、微生物の検出において必要とされる試料の前処理方法であって、フェノール等の有機溶媒を必須とする一般的な核酸抽出方法を必要とすることなく、簡便に実施できる前処理方法の提供を一つの目的とする。また、その前処理方法によって調製された前処理液を検出対象試料液として微生物を検出する方法の提供を一つの目的とする。さらに、その前処理方法によって、微生物を検出する方法に供される検出対象試料液の調製方法の提供を一つの目的とする。さらにまた、微生物検出のための前処理用キットの提供を一つの目的とする。また、微生物検出用キットの提供を一つの目的とする。
【０００８】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の１つの目的は、簡便でありながら、高感度に、検体試料中に含まれる微生物を検出する手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意研究を行った結果、液状試料中の微生物の存否を確認する場合においては、液状試料（生体試料、食品試料等）を遠心して沈降物を回収した後、沈降物に水又はアルカリ性溶液を添加し、得られた液中の微生物を短時間撹拌する前処理方法によって、簡便で、有機溶媒を必須とすることなく、微生物の検出に適した検出対象試料液が得られることを見出し本発明を完成させた。代表的な本発明を以下のとおりである。
【００１０】
本発明は、以下の態様を包含する。
［項１］
微生物の検出方法に供される液状試料の前処理方法であって、以下の工程Ａ～Ｃ：
（Ａ）液状試料に遠心操作を行い、遠心後の沈降物を回収する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた沈降物に水又はアルカリ性溶液を添加する工程、及び
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた液を１～２０秒間撹拌する工程、
を包含する、方法。
［項２］
液状試料が、尿、唾液、鼻咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、喀痰懸濁液、及び液状輸送培地に懸濁されたスワブ検体からなる群より選択される少なくとも１種である、項１に記載の方法。
［項３］
前記工程Ｂにおいて、アルカリ性溶液が、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも一つである、項１又は２に記載の方法。
［項４］
前記工程Ｂにおいて、アルカリ性溶液のｐＨが８．０以上である、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
［項５］
前記工程Ｃにおいて撹拌する工程が、ボルテックスミキサーによる撹拌処理を含む、項１～４のいずれか一項に記載の方法。
［項６］
微生物の検出方法が、微生物由来の核酸を検出する方法である、項１～５のいずれか一項に記載の方法。
［項７］
検出対象微生物が、クロストリジウム・ディフィシル、赤痢菌、サルモネラ菌、大腸菌、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、結核菌群、非結核性抗酸菌、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、ヒトメタニューモウイルス、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、パラ百日咳菌、肺炎クラミジア、クラミジア・トラコマチス、ナイセリア・ゴノレア、トリコモナス原虫、マイコプラズマ・ジェニタリウム、オウム病クラミジア、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群より選択される少なくとも一つである、項１～６のいずれか一項に記載の方法。
［項８］
更に以下の工程Ｄを包含する、項１～７のいずれか一項に記載の方法：
（Ｄ）前記工程Ｃで得られた撹拌処理液を精製する工程。
［項９］
項１～８のいずれか一項に記載の工程Ｃで得られた撹拌処理液を検出対象試料液とする微生物の検出方法。
［項１０］
微生物の検出方法に供される検出対象試料液の調製方法であって、
以下の工程Ａ～Ｃ：
（Ａ）液状試料に遠心操作を行い、遠心後の沈降物を回収する工程、
（Ｂ）前記工程Ａで得られた沈降物に水又はアルカリ性溶液を添加する工程、及び
（Ｃ）前記工程Ｂで得られた液を１～２０秒間撹拌する工程、
を包含する、方法。
［項１１］
上記前記工程Ｂに使用するためのアルカリ性溶液を含む、項１～１０のいずれか一項に記載の方法に用いるための試薬。
［項１２］
アルカリ性溶液が、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも一つである、項１１に記載の試薬。
［項１３］
前記アルカリ性溶液のｐＨが８．０以上である、項１１又は１２に記載の試薬。
［項１４］
上記前記工程Ｂに使用するためのアルカリ性溶液を含む、項１～１０のいずれか一項に記載の方法に用いるためのキット。
［項１５］
液状試料の遠心沈降物に添加するためのアルカリ性溶液と、プライマーセットからなるプライマーミックスを含むＰＣＲ用反応試薬とを含む、液状試料に含まれ得る微生物を検出するためのキット。
［項１６］
アルカリ性溶液が、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも一つである、項１５に記載のキット。
［項１７］
前記アルカリ性溶液のｐＨが８．０以上である、項１５又は１６に記載のキット。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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