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公開番号2025127817
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-09-02
出願番号2024024738
出願日2024-02-21
発明の名称修飾オリゴヌクレオチドを導入した核酸を用いた標的核酸配列の増幅方法
出願人デンカ株式会社
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/6858 20180101AFI20250826BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】修飾オリゴヌクレオチドを導入した核酸を用いた標的核酸配列の増幅方法の提供。
【解決手段】本発明は、修飾オリゴヌクレオチドを導入した核酸を用いた標的核酸配列の増幅方法であって、増幅反応が、1番目から289番目のアミノ酸が欠失しているサーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)由来のポリメラーゼと少なくとも90%の相同性を有し、且つDNAポリメラーゼ活性を有する酵素の存在下で実施される、方法、を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
修飾オリゴヌクレオチドを導入した核酸を用いた標的核酸配列の増幅方法であって、増幅反応が、１番目から２８９番目のアミノ酸が欠失しているサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のポリメラーゼと少なくとも９０％の相同性を有し、且つＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の存在下で実施される、方法。
続きを表示（約 690 文字）【請求項２】
標的核酸配列が、変異を有する配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
修飾オリゴヌクレオチドを導入した核酸が、野生型の標的核酸配列と二本鎖を形成することで、野生型の標的核酸配列の増幅を阻害する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
修飾オリゴヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
酵素が、宿主で発現されることで産生される酵素である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
酵素が、細胞壁が破壊された宿主を、６４℃未満の温度であって、宿主細胞由来のタンパク質が変性する温度で加熱する工程を含む方法で産生される酵素である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞壁が破壊された宿主を６５℃以上の温度で加熱する工程を含む方法で産生された、酵素の存在下で増幅反応を実施する場合よりも、野生型の標的核酸配列の増幅がさらに阻害される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
増幅反応の反応液における、修飾オリゴヌクレオチドの濃度が１００ｎM未満である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
増幅反応がＰＣＲで実施される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は広く、修飾オリゴヌクレオチドを導入した核酸を用いた標的核酸配列の増幅方法等に関する。
続きを表示（約 2,600 文字）【背景技術】
【０００２】
核酸の修飾は、リン酸部の修飾、糖部の修飾、又は塩基部の修飾に分類することができる。中でも、糖部の修飾は、揺らぎのある糖部の構造を安定化し、その結果、修飾された核酸は、相補鎖への結合が強固になることが知られている。相補鎖への結合が強固になることにより、Ｔｍ値が上昇し、また特異性が向上する。そのような修飾された核酸として、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ブリッジド核酸（ＢＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、セリノール核酸（ＳＮＡ）等が開発されてきた。
【０００３】
安定した二本鎖核酸を形成することができる上記の修飾核酸は、その配列特異性や、安定性の高さから、プライマー、標識プローブ、増幅を阻害するためのクランプ等の用途として活用することができる。
【０００４】
増幅を阻害する用途で使用される修飾核酸は、特に、変異の検出に有用であることが知られている。野生型配列に相補的な修飾核酸を有する配列が、野生型配列と強固な二本鎖を形成し、ポリメラーゼによる伸長反応においても、その二本鎖構造を保持することで、野生型配列の増幅を阻害することができる。その結果、変異型配列を特異的に増幅し、変異を検出することが可能になる。
【０００５】
例えば、修飾核酸としてロックド核酸（ＬＮＡ）を用いて特定の配列の増幅を阻害するＰＣＲ等の増幅反応に用いられるポリメラーゼとしては、例えば、正確性（フィデリティ）の指標となるプルーフリーディング活性（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性）を有するポリメラーゼ等が用いられてきた（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
ＬｏｎｅＨｕｍｍｅｌｓｈｏｊｅｔａｌ．ＬｏｃｋｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｉｎｈｉｂｉｔｓａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇＤＮＡｉｎｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００５，３８（４），６０５－６１０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、修飾オリゴヌクレオチドを導入した核酸を用いた標的核酸配列の増幅反応にこれまでに用いられたことがない、新規なポリメラーゼを提供することを目的とする。修飾オリゴヌクレオチドを導入した核酸を用いた標的核酸配列の増幅反応において、高い活性で標的核酸配列以外の配列の増幅を阻害することが可能な、新規なポリメラーゼを提供することも目的の一つである。
【０００８】
本発明はさらに、これらのポリメラーゼを用いた、標的核酸配列の増幅方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討した結果、プルーフリーディング活性（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性）を有さない、特定の領域のアミノ酸が欠失しているサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のポリメラーゼと相同性の高い酵素が、修飾オリゴヌクレオチドを導入した核酸を用いた標的核酸配列の増幅反応に用いることができることを見出した。また、当該ポリメラーゼが宿主で発現されることで産生される場合、宿主由来のタンパク質を所定の温度で加熱する工程を含む方法で産生されたポリメラーゼを増幅反応に用いることで、より高い活性で標的核酸配列以外の配列の増幅を阻害することができることを見出した。
【００１０】
すなわち、本願は以下の発明を包含する。
（１）修飾オリゴヌクレオチドを導入した核酸を用いた標的核酸配列の増幅方法であって、増幅反応が、１番目から２８９番目のアミノ酸が欠失しているサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のポリメラーゼと少なくとも９０％の相同性を有し、且つＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の存在下で実施される、方法。
（２）標的核酸配列が、変異を有する配列である、（１）に記載の方法。
（３）修飾オリゴヌクレオチドを導入した核酸が、野生型の標的核酸配列と二本鎖を形成することで、野生型の標的核酸配列の増幅を阻害する工程を含む、（２）に記載の方法。
（４）修飾オリゴヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）である、（１）～（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）酵素が、宿主で発現されることで産生される酵素である、（１）～（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）酵素が、細胞壁が破壊された宿主を、６４℃未満の温度であって、宿主細胞由来のタンパク質が変性する温度で加熱する工程を含む方法で産生される酵素である、（５）に記載の方法。
（７）細胞壁が破壊された宿主を６５℃以上の温度で加熱する工程を含む方法で産生された、酵素の存在下で増幅反応を実施する場合よりも、野生型の標的核酸配列の増幅がさらに阻害される、（６）に記載の方法。
（８）増幅反応の反応液における、修飾オリゴヌクレオチドの濃度が１００ｎＭ未満である、（１）～（７）のいずれか１つに記載の方法。
（９）酵素が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない、（１）～（８）のいずれか１つに記載の方法。
（１０）増幅反応がＰＣＲで実施される、（１）～（９）のいずれか１つに記載の方法。
（１１）標的核酸配列を増幅するためのキットであって、
１）修飾オリゴヌクレオチドを導入した核酸と、
２）１番目から２８９番目のアミノ酸が欠失しているサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のポリメラーゼと少なくとも９０％の相同性を有し、且つＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、
を含むキット。
（１２）標的核酸配列が、変異を有する配列である、（１１）に記載のキット。
（１３）２）の酵素の存在下で増幅反応が実施される、（１１）又は（１２）に記載のキット。
（１４）修飾オリゴヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）である、（１１）～（１３）のいずれか１つに記載のキット。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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