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公開番号2025096192
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-26
出願番号2024212503
出願日2024-12-05
発明の名称改変5’非翻訳領域及びそれを用いた目的物質の製造方法
出願人花王株式会社
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類C12N 15/67 20060101AFI20250619BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】微生物による目的物質生産における生産性の向上。
【解決手段】改変プロモーターを含むDNA分子であって、該改変プロモーターは、異種ポリヌクレオチドを含有する改変5'UTRを含み、該異種ポリヌクレオチドは、配列番号70のヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、DNA分子。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
改変プロモーターを含むＤＮＡ分子であって、
該改変プロモーターは、異種ポリヌクレオチドを含有する改変５'ＵＴＲを含み、
該異種ポリヌクレオチドは、配列番号７０のヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、
ＤＮＡ分子。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
前記異種ポリヌクレオチドが、以下のａ）～ｄ）のポリヌクレオチドのいずれか：
ａ）配列番号３のヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号４のヌクレオチド配列もしくは当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片；
ｃ）配列番号５のヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
ｄ）配列番号６のヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
である、
請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記異種ポリヌクレオチドが配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記異種ポリヌクレオチドが長さ１００ｎｔ以下である、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記異種ポリヌクレオチドが前記改変５'ＵＴＲの３'末端に位置する、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記改変５'ＵＴＲが、前記異種ポリヌクレオチドに加えて、異種のリボゾーム結合領域を含有し、該リボゾーム結合領域は、該改変５'ＵＴＲに含まれる配列番号１のヌクレオチド配列からなる領域の上流に配置されている、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項７】
前記異種のリボゾーム結合領域が、前記異種ポリヌクレオチドの上流に配置されている、請求項６記載のＤＮＡ分子。
【請求項８】
前記異種のリボゾーム結合領域が、前記改変プロモーターの転写開始点から１０～１００ヌクレオチド下流に位置する、請求項６記載のＤＮＡ分子。
【請求項９】
前記改変プロモーターの親プロモーターがバチルス属由来のプロモーターである、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項１０】
前記親プロモーターが、配列番号７２のヌクレオチド配列もしくは当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであるか、又は配列番号７６のヌクレオチド配列もしくは当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、請求項９記載のＤＮＡ分子。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変５'非翻訳領域又はそれを含むプロモーターを含有するＤＮＡ分子、及びそれらを用いた目的物質の製造方法に関する。
続きを表示（約 2,800 文字）【背景技術】
【０００２】
微生物による物質の工業生産において、生産性の向上は重要な課題である。目的遺伝子の発現向上のための、プロモーター等の発現制御領域の改変に関する数多くの研究が以前より行なわれている。
【０００３】
特許文献１には、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＫＳＭ－Ｓ２３７株（ＦＥＲＭＢＰ－７８７５）及びＫＳＭ－６４株（ＦＥＲＭＢＰ－２８８６）のアルカリセルラーゼ遺伝子由来の、ｃａｔａｂｏｌｉｔｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ（ｃｒｅ）様配列を変異させた改変プロモーターが、目的遺伝子の発現を向上させることが記載されている。特許文献２には、ＫＳＭ－６４株のアルカリセルラーゼ遺伝子プロモーター領域のヌクレオチド配列の３２６位から３３０位の間に塩基挿入した改変プロモーターが目的遺伝子の発現を向上させることが記載されている。特許文献３、４には、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ遺伝子から得られる５'非翻訳領域（５'ＵＴＲ）配列を異種遺伝子と作動可能に連結して、該遺伝子の発現を向上させることが記載されている。特許文献５には目的遺伝子のプロモーター領域の下流かつリボゾーム結合領域の上流に、Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を追加した改変ｍＲＮＡプロセシング／安定化配列（mRNA processing/stabilizing sequence）を連結し、該目的遺伝子の発現を向上させることが記載されている。特許文献６には、ステムループを形成する特定のＤＮＡ配列を、目的物質の合成に関する遺伝子の転写開始部位より７ヌクレオチド以上下流に導入することによって、該目的物質の産生を増大する方法が記載されている。非特許文献１には、枯草菌においてsacBのリプレッサー遺伝子sacRの５'ＵＴＲにＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ様配列を導入することで、sacBの発現を制御したこと、導入数及び導入位置により発現が増加又は減少したことが記載されている。非特許文献２には、バチルス属において目的遺伝子の５'ＵＴＲ領域にリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンを含む配列を複数個導入することにより、目的遺伝子の発現が向上したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
特開２０１１－１０３８７５号公報
特開２０００－０７８９８１号公報
特表２０１８－５０５６８６号公報
特表２０２０－５３４８２１号公報
国際公開公報第２００８／１４０６１５号
特表２００９－５１８０１９号公報
【非特許文献】
【０００５】
Lett Appl Microbiol, 2005, 41(2):221-226
Nucleic Acids Research, 2022, 50(20):11979-11990
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
微生物による目的物質生産における生産性の向上が望まれる。本発明は、遺伝子の発現を促進する改変５'ＵＴＲ又はそれを含むプロモーターを含有するＤＮＡ分子、及びそれらを用いた目的物質の製造方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、微生物中の目的遺伝子のプロモーターに含まれる５'ＵＴＲの少なくとも一部を、バチルス属菌エンドグルカナーゼ遺伝子の５'ＵＴＲに由来する特定のＤＮＡ断片と置き換えることで、当該目的遺伝子の発現が顕著に促進されることを見出した。
【０００８】
したがって、一実施形態において、本発明は、改変プロモーターを含むＤＮＡ分子であって、
該改変プロモーターは、異種ポリヌクレオチドを含有する改変５'ＵＴＲを含み、
該異種ポリヌクレオチドは、配列番号７０のヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、
ＤＮＡ分子、を提供する。
別の一実施形態において、本発明は前記ＤＮＡ分子を含有する形質転換体を提供する。
さらに別の一実施形態において、本発明は、前記形質転換体を培養することを含む目的物質の製造方法を提供する。
さらに別の一実施形態において、本発明は、改変プロモーターの製造方法であって、
該方法は、親プロモーターに含まれる５'ＵＴＲを改変することを含み、
該５'ＵＴＲの改変は、該５'ＵＴＲの一部又は全部を異種ポリヌクレオチドで置換するか、又は該５'ＵＴＲに該異種ポリヌクレオチドを付加することを含み、
該異種ポリヌクレオチドは、該異種ポリヌクレオチドは、配列番号７０のヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであり、
該親プロモーターは、該異種ポリヌクレオチドを含まない５'ＵＴＲを含むプロモーターである、
方法、を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、微生物による目的物質の生産性を顕著に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
実施例２で構築した改変５'ＵＴＲを含むＰ
SP64
プロモーター。斜線部は親配列と置換された領域を表す。
実施例３で構築した改変５'ＵＴＲを含むｓｐｏＶＧプロモーター。斜線部は親配列と置換された領域を表す。
実施例７で構築した改変５'ＵＴＲと異種ＲＢＳを含むＰ
SP64
プロモーター。斜線部は親配列と置換された領域を表し、黒色バーは異種ＲＢＳを表す。
ｐｒｓＡ過剰発現株の作製方法。
改変５'ＵＴＲを含むＰ
SP64
プロモーターによるＫＰ４３プロテアーゼ生産性向上。
改変５'ＵＴＲを含むｓｐｏＶＧプロモーターによるＫＰ４３プロテアーゼ生産性向上。
改変５'ＵＴＲを含むＰ
SP64
プロモーターによるアミラーゼ生産性向上。
改変５'ＵＴＲを含むｓｐｏＶＧプロモーターによるアミラーゼ生産性向上。
改変５'ＵＴＲを含むＰ
SP64
プロモーターによるＣｒｙ５Ｂ生産性向上。
改変５'ＵＴＲを含むＰ
SP64
プロモーターによるリパーゼ生産性向上。
改変５'ＵＴＲと追加ＲＢＳを含むＰ
SP64
プロモーターによるＣｒｙ５Ｂ生産性向上。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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