特許ウォッチ

公開番号2025048723
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-03
出願番号2024090265
出願日2024-06-03
発明の名称細胞、細胞を用いたタンパク質を発現させる方法、発現コンストラクト及び形質転換細胞
出願人国立大学法人長崎大学
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/10 20060101AFI20250326BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】タンパク質分子間相互作用がもたらすシグナルの伝達経路を変換し、より高感度にシグナルを検出し、さらにそれを別のシグナルに転換できる細胞、細胞を用いたタンパク質を発現させる方法、発現コンストラクト及び形質転換細胞の提供。
【解決手段】インターフェロンα及びβ受容体1の細胞内ドメインの少なくとも一部と、第1膜貫通ドメインと、第1細胞外ドメインとを含む第1融合膜タンパク質分子と、インターフェロンα及びβ受容体2の細胞内ドメインの少なくとも一部と、第2膜貫通ドメインと、第2細胞外ドメインとを含む第2融合膜タンパク質分子と、を細胞膜に含む細胞であって、前記第1細胞外ドメインと前記第2細胞外ドメインとが、直接又は間接的に結合が可能である、細胞。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
インターフェロンα及びβ受容体１の細胞内ドメインの少なくとも一部と、第１膜貫通ドメインと、第１細胞外ドメインとを含む第１融合膜タンパク質分子と、
インターフェロンα及びβ受容体２の細胞内ドメインの少なくとも一部と、第２膜貫通ドメインと、第２細胞外ドメインとを含む第２融合膜タンパク質分子と、を細胞膜に含む細胞であって、
前記第１細胞外ドメインと前記第２細胞外ドメインとが、直接又は間接的に結合が可能である、細胞。
続きを表示（約 910 文字）【請求項２】
前記第１膜貫通ドメインが、前記インターフェロンα及びβ受容体１の膜貫通ドメインに由来するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記第１融合膜タンパク質分子が、さらにインターフェロンα及びβ受容体１の細胞外ドメインの一部を含み、前記細胞外ドメインの一部が前記第１細胞外ドメインと前記第１膜貫通ドメインの間に位置している、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記第１細胞外ドメインと前記第２細胞外ドメインが、標的物質を間に挟んで結合が可能である、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記標的物質は、２以上のタンパク質が結合している複合タンパク質である、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記標的物質が、サイトカイン、抗体又はアフィボディを含む、請求項４に記載の細胞。
【請求項７】
前記サイトカインが、インターフェロンγ、インターロイキン－１、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン－６、インターロイキン－１０、インターロイキン－１２、インターロイキン－１７、インターロイキン－１８、腫瘍壊死因子－α及びトランスフォーミング増殖因子－βのうちの少なくとも一種である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
内在性のインターフェロンα及びβ受容体１がノックアウトされている、請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎細胞由来細胞）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎細胞由来細胞）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん由来細胞）、Ａ５４９細胞（ヒト肺がん由来細胞）、ＭＣＦ－７細胞（ヒト乳がん由来細胞）又はＡ４３１細胞（ヒト上皮様細胞がん由来細胞）である、請求項１に記載の細胞。
【請求項１０】
さらに、インターフェロン応答配列（ＩＳＲＥ）と、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を少なくとも一つ含むＩＳＲＥ－誘導性発現ユニットが導入されている、請求項１に記載の細胞。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、細胞を用いたタンパク質を発現させる方法、発現コンストラクト及び形質転換細胞に関する。
続きを表示（約 10,000 文字）【背景技術】
【０００２】
細胞外及び細胞内の様々なシグナル伝達は、二つ又はそれ以上の分子間の特異的相互作用を介して行われる。ルシフェラーゼの一種であるＮａｎｏＬｕｃ（登録商標、Ｎｌｕｃと表記することがある）は、分子量が小さく、酵素活性が強く安定していることから、様々な生物学的シグナルのレポーターとして広く用いられている（非特許文献１）。
【０００３】
タンパク質間相互作用を検出するために、ＬｇＢｉＴと呼ばれる大サブユニットとＳｍＢｉＴと呼ばれる小サブユニットの２つのサブユニットシステムを用いた相補性レポーターであるＮａｎｏＢｉＴが開発されている（非特許文献２）。目的のタンパク質と融合可能なサブユニットは、ＬｇＢｉＴ又はＳｍＢｉＴと結合されている。これらのサブユニットが目的のタンパク質と結合することによって、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴが近接し発光シグナルを与える機能的な酵素を形成する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
Hall MP, et al., Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate, ACS Chem Biol. 7, 1848 (2012)
Dixon AS, et al., NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells, ACS Chem Biol. 11, 400 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献２に記載される方法でタンパク質間相互作用を検出する場合、目的のタンパク質の種類や量によって、発光シグナルが十分でない場合がある。
【０００６】
本発明者らは、タンパク質間相互作用を検出する際に、インターフェロンα及びβ受容体の細胞内ドメインを利用し、そのシグナルをＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路に転換することでシグナルを増強することに思い至った。また本発明者らは、シグナル検出に関与するタンパク質だけでなく、増殖因子等の他のタンパク質を発現させ、共培養した細胞の機能を制御することにも思い至った。
【０００７】
すなわち本発明は、シグナル検出に関与するタンパク質等の発現量が向上された細胞、細胞を用いたタンパク質を発現させる方法、発現コンストラクト及び形質転換細胞の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の態様を包含する。
［１］インターフェロンα及びβ受容体１の細胞内ドメインの少なくとも一部と、第１膜貫通ドメインと、第１細胞外ドメインとを含む第１融合膜タンパク質分子と、
インターフェロンα及びβ受容体２の細胞内ドメインの少なくとも一部と、第２膜貫通ドメインと、第２細胞外ドメインとを含む第２融合膜タンパク質分子と、を細胞膜に含む細胞であって、
前記第１細胞外ドメインと前記第２細胞外ドメインとが、直接又は間接的に結合が可能である、細胞。
［２］前記第１膜貫通ドメインが、前記インターフェロンα及びβ受容体１の膜貫通ドメインに由来するアミノ酸配列を有する、［１］に記載の細胞。
［３］前記第１融合膜タンパク質分子が、さらにインターフェロンα及びβ受容体１の細胞外ドメインの一部を含み、前記細胞外ドメインの一部が前記第１細胞外ドメインと前記第１膜貫通ドメインの間に位置している、［２］に記載の細胞。
［４］前記第１細胞外ドメインと前記第２細胞外ドメインが、標的物質を間に挟んで結合が可能である、［１］～［３］のいずれか一項に記載の細胞。
［５］前記標的物質は、２以上のタンパク質が結合している複合タンパク質である、［４］に記載の細胞。
［６］前記標的物質が、サイトカイン、抗体又はアフィボディを含む、［４］に記載の細胞。
［７］前記サイトカインが、インターフェロンγ、インターロイキン－１、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン－６、インターロイキン－１０、インターロイキン－１２、インターロイキン－１７、インターロイキン－１８、腫瘍壊死因子－α及びトランスフォーミング増殖因子－βのうちの少なくとも一種である、［６］に記載の細胞。
［８］内在性のインターフェロンα及びβ受容体１がノックアウトされている、請求項１に記載の細胞。
［９］前記細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎細胞由来細胞）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎細胞由来細胞）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん由来細胞）、Ａ５４９細胞（ヒト肺がん由来細胞）、ＭＣＦ－７細胞（ヒト乳がん由来細胞）又はＡ４３１細胞（ヒト上皮様細胞がん由来細胞）である、［１］～［８］のいずれか一項に記載の細胞。
［１０］さらに、インターフェロン応答配列（ＩＳＲＥ）と、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を少なくとも一つ含む、ＩＳＲＥ－誘導性発現ユニットが導入されている、［１］～［９］のいずれか一項に記載の細胞。
［１１］前記ＩＳＲＥ－誘導性発現ユニットが複数導入されており、複数の前記ＩＳＲＥ－誘導性発現ユニットに含まれる前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列が互いに異なる、［１０］に記載の細胞。
［１２］前記ＩＳＲＥ－誘導性発現ユニットは、前記インターフェロン応答配列を４個以上含む、［１０］又は［１１］に記載の細胞。
［１３］前記ヌクレオチド配列が、シグナルを発する反応に関与するタンパク質をコードしている、［１０］～［１２］のいずれか一項に記載の細胞。
［１４］前記シグナルを発する反応に関与するタンパク質が、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、フォスファターゼ及びペルオキシダーゼのうちの一つである、［１３］に記載の細胞。
［１５］前記ヌクレオチド配列が、細胞の増殖、活性化及び分化を制御する分子並びに細胞間相互作用を制御する分子の少なくとも１つのタンパク質をコードしている、［１０］～［１２］のいずれか一項に記載の細胞。
［１６］前記増殖を制御する分子が、インターロイキン－２である、［１５］に記載の細胞。
［１７］前記細胞の分化を制御する分子が、インターフェロンγ、インターロイキン－４、インターロイキン－６、インターロイキン－１０、インターロイキン－１２、インターロイキン－１７、インターロイキン－２３、腫瘍壊死因子－α及びトランスフォーミング増殖因子－βのうちの１つである、［１５］に記載の細胞。
［１８］前記細胞の活性化を制御する分子が、活性化を促進する共刺激分子であるＢ７－１、Ｂ７－２、ＣＤ４０及び４－１ＢＢリガンド、並びに活性化を抑制する共阻害分子であるＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１及びガレクチン－９のうちの少なくとも一種である［１５］に記載の細胞。
［１９］前記細胞間相互作用を制御する分子が細胞膜結合型の抗ＣＤ４－ｓｃＦｖ－ＴＭ、抗ＣＤ４－ＣＣＲ６－ｓｃＦｖ－ＴＭ又はＺＺ－アフィボディ－ＴＭである、［１５］に記載の細胞。
［２０］前記第１細胞外ドメインと前記第２細胞外ドメインが、標的物質を間に挟んで結合が可能であり、
前記標的物質が前記タンパク質と同一の構造のタンパク質を含む、［１０］～［１９］のいずれか一項に記載の細胞。
［２１］［１］～［２０］のいずれか一項に記載の細胞を用い、
前記細胞において、前記第１細胞外ドメインと前記第２細胞外ドメインとを直接的又は間接的に結合させることと、
前記結合により前記インターフェロンα及びβ受容体１の細胞内ドメインの少なくとも一部と前記インターフェロンα及びβ受容体２の細胞内ドメインの少なくとも一部とを近接させることで、前記細胞内に存在するインターフェロン応答配列を介して、その下流のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が転写され、タンパク質を発現させることと、を含むタンパク質を発現させる方法。
［２２］細胞内で機能する発現用の第１プロモーターと、前記第１プロモーターに作動的に連結された、インターフェロンα及びβ受容体１の細胞内ドメインの少なくとも一部と、第１膜貫通ドメインと、第１細胞外ドメインとを含む第１融合膜タンパク質分子をコードするヌクレオチド配列と、を含む第１発現コンストラクトを含み、
前記第１細胞外ドメインは、インターフェロンα及びβ以外の標的物質と結合可能である、発現コンストラクト。
［２３］前記第１膜貫通ドメインをコードしたヌクレオチド配列が、前記インターフェロンα及びβ受容体１の膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列である、［２２］に記載の発現コンストラクト。
［２４］前記第１融合膜タンパク質分子が、さらにインターフェロンα及びβ受容体１の細胞外ドメインの一部を含み、前記細胞外ドメインの一部をコードするヌクレオチド配列が前記第１細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列と前記第１膜貫通ドメインをコードしたヌクレオチド配列の間に位置している、［２３］に記載の発現コンストラクト。
［２５］さらに、細胞内で機能する発現用の第２プロモーターと、前記第２プロモーターに作動的に連結された、インターフェロンα及びβ受容体２の細胞内ドメインの少なくとも一部と、第２膜貫通ドメインと、第２細胞外ドメインとを含む第２融合膜タンパク質分子をコードするヌクレオチド配列と、を含む、第２発現コンストラクトを含み、
前記第１細胞外ドメインと前記第２細胞外ドメインとが、直接又は間接的に結合が可能である、［２２］～［２４］のいずれか一項に記載の発現コンストラクト。
［２６］前記第１細胞外ドメインと前記第２細胞外ドメインが、前記標的物質を間に挟んで結合が可能である、［２５］に記載の発現コンストラクト。
［２７］前記標的物質は、２以上のタンパク質が結合している複合タンパク質である、［２６］に記載の発現コンストラクト。
［２８］前記標的物質が、サイトカイン、抗体又はアフィボディを含む、［２６］に記載の発現コンストラクト。
［２９］前記サイトカインが、インターフェロンγ、インターロイキン－１、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン－６、インターロイキン－１０、インターロイキン－１２、インターロイキン－１７、インターロイキン－１８、腫瘍壊死因子－α及びトランスフォーミング増殖因子－βのうちの少なくとも一種である、［２８］に記載の発現コンストラクト。
［３０］前記発現コンストラクトは、プラスミドベクターベースの発現コンストラクトである、［２２］～［２９］のいずれか一項に記載の発現コンストラクト。
［３１］［２２］～［３０］のいずれか一項のいずれか一項に記載の発現コンストラクトが遺伝子導入された、形質転換細胞。
【発明の効果】
【０００９】
上記態様によれば、タンパク質分子間相互作用がもたらすシグナルの伝達経路を変換し、より高感度にシグナルを検出し、さらにそれを別のシグナルに転換できる細胞、細胞を用いたタンパク質を発現させる方法、発現コンストラクト及び形質転換細胞を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
一実施形態に係る細胞の概略図である。
一実施形態に係る細胞の概略図である。
ＨＥＲ２－ＥＸ（細胞外ドメイン）と抗ＨＥＲ２アフィボディの特異的結合による、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２を介したシグナル伝達を示す概略図（ＩＦＮＡＲＲＳ法）である。
実施例（ＩＦＮＡＲＲＳ法）で使用した融合膜タンパク質を示す図である。
実施例（ＩＦＮＡＲＲＳ法）で使用した融合膜タンパク質の組み合わせによるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
実施例（ＩＦＮＡＲＲＳ法）で使用した融合膜タンパク質の組み合わせによるＨＥＲ２－ＥＸと抗ＨＥＲ２アフィボディの特異的結合に依存したルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
実施例（ＩＦＮＡＲＲＳ法）におけるＩＳＲＥの数に応じた発現ベクター（Ａ）と、それを使用したシフェラーゼ活性のグラフ（Ｂ）である。
比較例（ＮａｎｏＢｉＴ法）としてＨＥＲ２－ＥＸと抗ＨＥＲ２アフィボディの特異的結合による、ＳｍＢｉＴとＬｇＢｉＴの近接化がシフェラーゼ活性を示す概略図である。
比較例（ＮａｎｏＢｉＴ法）として使用した融合膜タンパク質を示す図である。
比較例（ＮａｎｏＢｉＴ法）として使用した融合膜タンパク質の組み合わせによるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
実施例（ＩＦＮＡＲＲＳ法）及び比較例（ＮａｎｏＢｉＴ法）として使用した融合膜タンパク質の組み合わせのルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメイン、ＺＺ－アフィボディ（抗体のＦｃ領域と結合する）及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合による、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２を介したシグナル伝達を示す概略図である。
実施例で使用した融合膜タンパク質を示す図である。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＰＤ－Ｌ１への特異的結合に依存したルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
Ａは、短いリンカーペプチドを介したＰＤ１－ＥＸと抗ＨＥＲ２アフィボディ融合タンパク質を用いてＰＤ１とＰＤ－Ｌ１の結合を示す図であり、Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体によるＰＤ１とＰＤ－Ｌ１の結合の阻害が特異的であることを示す図である。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＧＳＴ－抗体（ネガティブ・コントロール）を用いてＰＤ１とＰＤ－Ｌ１の結合阻害を、ルシフェラーゼ活性で示すグラフである。
ＩＦＮＡＲ２及びＩＦＮＡＲ１の細胞内ドメインのみでシグナルを伝えるか調べるための実施例で使用した融合膜タンパク質を示す図である。
ルシフェラーゼ活性がＩＦＮＡＲ２及びＩＦＮＡＲ１の細胞内ドメインのみでシグナルを伝えることを示すグラフである。
抗ＨＥＲ２アフィボディの二量体を標的物質として用い、ＮａｎｏＢｉＴ法とＩＦＮＡＲＲＳ法の比較を示す概略図である。
実施例（ＩＦＮＡＲＲＳ法）で使用した融合膜タンパク質を示す図である。
比較例（ＮａｎｏＢｉＴ法）として使用した融合膜タンパク質を示す図である。
比較例（ＮａｎｏＢｉＴ法）における抗ＨＥＲ２アフィボディの二量体を標的物質として用いた場合のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
抗ＨＥＲ２アフィボディの二量体を標的物質として用い、ＮａｎｏＢｉＴ法とＩＦＮＡＲＲＳ法を比較した、ルシフェラーゼ活性を示す。
ＩＦＮγを標的物質として、ＩＦＮγによるＩＦＮＧＲ１の二量体化の検出をＮａｎｏＢｉＴ法（Ａ）とＩＦＮＡＲＲＳ法（Ｂ）で比較する概略図である。
実施例（ＩＦＮＡＲＲＳ法）で使用した融合膜タンパク質を示す図である。
比較例（ＮａｎｏＢｉＴ法）として使用した融合膜タンパク質を示す図である。
比較例（ＮａｎｏＢｉＴ法）として使用した融合膜タンパク質では、いずれの組み合わせでもＩＦＮγ-依存性のＩＦＮＧＲ１二量体化を検出できないことを示すグラフである。
ＩＦＮγ-依存性のＩＦＮＧＲ１二量体化をＮａｎｏＢｉＴ法とＩＦＮＡＲＲＳ法で比較した、ルシフェラーゼの活性を示すグラフである。
ＩＦＮＡＲＲＳ法のＩＦＮγを分泌する活性化Ｔ細胞の検出、活性化及び増殖促進への利用を説明する概略図である。
ＩＦＮＧＲ１とＩＦＮＧＲ２の細胞外ドメインを利用したＩＦＮＡＲＲＳ法の概略図である。
実施例で使用した融合膜タンパク質を示す図である。
実施例で使用した融合膜タンパク質の組み合わせによるＩＦＮγ-依存性のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
実施例で使用した融合膜タンパク質と、ＩＦＮγ-容量依存性の、ＩＳＲＥ×７－ＩＦＮＧによる感度の上昇を示す図である。
実施例で使用した細胞（トランスフェクションと薬剤選択で得られた複数の安定発現株）のＩＦＮγ-依存性のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
実施例で使用したｓｇＲＮＡ発現をするドナープラスミドの構造と、相同性組み換えによる内在性のＩＦＮＡＲ１のノックアウトに伴う、ゲノム構造変化の概略を示す図である。
実施例の各細胞株におけるＩＦＮα又はＩＦＮγ刺激によるルシフェラーゼ活性を示す図である。
実施例の内在性のＩＦＮＡＲ１のノックアウト前後のＩＦＮα又はＩＦＮγ刺激によるルシフェラーゼ活性の変化を示す図である。
ＩＬ－２を標的物質として用いた場合のＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２を介したシグナル伝達を示す概略図である。
実施例で使用した融合膜タンパク質を示す図である。
実施例で使用した融合膜タンパク質分子の各組合せにおけるＩＬ－２刺激によるルシフェラーゼ活性（上）及びＩＬ２ＲＡサブユニット共発現によるＩＬ－２感受性と活性化の上昇（下）を示すグラフである。
実施例で使用した細胞株におけるＩＬ－２に対するルシフェラーゼ活性を示す図である。
実施例で使用した細胞株における各サイトカインに対するルシフェラーゼ活性を示す図である。
実施例で使用したＩＳＲＥ－ＩＬ－２発現ベクターと、各細胞株におけるＩＦＮγ刺激によりＧＲｋＳ－９７４細胞が分泌したＩＬ－２を２ＬＲｋ－１３４細胞が感知した図である。
実施例で使用したＧＲｋＳ－９７４細胞における各サイトカイン刺激によるＩＬ－２の分泌を示す図である。
ＧＲｋＳ－９７４細胞と共培養させたときのＣＴＬＬ－２細胞の増殖を表す顕微鏡画像である。
ＧＲｋＳ－９７４細胞と共培養させたときのＣＴＬＬ－２の細胞数を表すグラフである。
Ｊｕｒｋａｔ細胞に発現させるため、レンチウイルス作成に使用するベクターのコンストラクトを示す図である。ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド特異的ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）複合体、ＣＤ８α－ＥＧＦＰ、ＮＦＡＴ－ＲＥ（ＮｕｃｌｅａｒＦａｃｔｏｒｏｆＡｃｔｉｖａｔｅｄＴＣｅｌｌｓ－ＲｅｓｐｏｎｓｅＥｌｅｍｅｎｔ）－ＮＬｕｃＰ、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１－ｓｃＦｖ－２８ＢＢＺ（ＣＤ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ）。
ＧＲｋＳ－９７４細胞とＪｕｒｋａｔ－ＣＤ８／抗ＥＳＯ－ＴＣＲ細胞との共培養におけるＰＭＡ及びカルシウムイオノフォア又は抗ＣＤ３ε抗体での刺激、あるいはＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド付与によるルシフェラーゼ活性を示す図である。
ＩＦＮＡＲＲＳ法のＩＦＮγを分泌する活性化Ｔ細胞の検出（ＮＬｕｃＰ）、シグナル増強（ＩＦＮγ）及び細胞増殖刺激（ＩＬ－２）への利用を説明する概略図である。
ＧＲｋＳ－９７４細胞とＪｕｒｋａｔ－ＣＤ８／抗ＥＳＯ－ＴＣＲ細胞との共培養における抗ＣＤ３ε抗体での刺激、トランスフェクトによるＢ７－１あるいは抗ＣＤ３ε－ｓｃＦｖの強制発現によるルシフェラーゼ活性を示す図である。
ＧＲｋＳ－９７４細胞とＪｕｒｋａｔ－ＣＤ８／抗ＥＳＯ－ＴＣＲ細胞との共培養におけるＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド付与によるルシフェラーゼ活性を示す図である。
実施例で使用した発現ベクターを示す図である。
実施例で使用した発現ベクターの一部と、ＩＦＮγ－依存性のＢ７－１及び抗ＣＤ３ε－ｓｃＦｖの発現誘導によるルシフェラーゼ活性を示す図である。
ＩＳＲＥ－依存プロモーターと、ＧＡＳ（ｇａｍｍａｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｓｉｔｅ）－依存性プロモーターのホタルルシフェラーゼ活性を比較した図である。
ＲＩＧ－Ｉ及びＩＳＲＥ－ホタルルシフェラーゼを安定して発現する２９３Ｔ細胞のＩＦＮα刺激によるホタルルシフェラーゼの活性化を示す図である。
ＧＲｋＳ－９７４細胞おける各サイトカインに対するルシフェラーゼ活性を示す図である。
比較実験として、ＰＭＡ／Ｃａで処理した所定の数のＪｕｒｋａｔ－ＣＤ８／抗ＥＳＯ－ＴＣＲ細胞の活性化を、ＥＬＩＳＡアッセイで検出したプレートの画像である。
比較実験として、ＰＭＡ／Ｃａで処理した所定の数のＪｕｒｋａｔ－ＣＤ８／抗ＥＳＯ－ＴＣＲ細胞の活性化を、ＥＬＩＳＡアッセイで検出した吸光度を統計処理した結果（ＩＦＮγ濃度として）を示す図である。
比較実験として、ＰＭＡ／Ｃａで処理した所定の数のＪｕｒｋａｔ－ＣＤ８／抗ＥＳＯ－ＴＣＲ細胞の活性化を、ＧＲｋＳ－９７４細胞を用いたＩＦＮＡＲＲＳにより検出した結果を示す図である。
比較実験として、ＰＭＡ／Ｃａ又は抗ＣＤ３ε抗体で処理した所定の数のＪｕｒｋａｔ－ＣＤ８／抗ＥＳＯ－ＴＣＲ細胞の活性化を、ＥＬＩＳｐｏｔで検出した画像である。
比較実験として、ＰＭＡ／Ｃａ又は抗ＣＤ３ε抗体で処理した所定の数のＪｕｒｋａｔ－ＣＤ８／抗ＥＳＯ－ＴＣＲ細胞の活性化を、ＥＬＩＳｐｏｔで検出したスポットの数を統計処理した結果を示す図である。
比較実験として、ＰＭＡ／Ｃａ又は抗ＣＤ３ε抗体で処理した所定の数のＪｕｒｋａｔ－ＣＤ８／抗ＥＳＯ－ＴＣＲ細胞の活性化を、ＧＲｋＳ－９７４細胞を用いたＩＦＮＡＲＲＳにより検出した結果を示す図である。
ＧＲｋＳ－９７４細胞、ＧＲｋＳＢ－０４３細胞及びＧＲｋＳＢＺ－１８８細胞の抗Ｂ７－１抗体を用いたドットブロットアッセイの結果を示す画像である。
ＧＲｋＳ－９７４細胞、ＧＲｋＳＢ－０４３細胞及びＧＲｋＳＢＺ－１８８細胞の抗ＣＤ３ε－ｓｃＦｖの発現を示すＲＴ－ＰＣＲ画像である。
ＧＲｋＳＢ－０４３細胞の表面ＺＺ－ＴＭに対するＩＧＨＧ１の特異的結合示す図である。
ＧＲｋＳＢ－０４３細胞の表面ＺＺ－ＴＭに対する抗ＨＥＲ２－ｓｃＦｖ－ＩＧＨＧ１の特異的結合示す図である。
ＧＲｋＳＢ－０４３細胞の表面にＺＺ－ＴＭを発現させるためのコンストラクト、及びこのＺＺの機能的発現（抗体のＦｃ領域に結合）を確認するために使用した各分子のコンストラクトを示す図である。
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｎｌｕｃ細胞をＰＭＡ／Ｃａ又、抗ＣＤ３ε抗体等で刺激した際のルシフェラーゼ活性を示す図である。
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｎｌｕｃ／抗ＥＳＯ－２８ＢＢＺ細胞をＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド付与したＨＥＫ２９３Ｔ細胞と共培養した際のルシフェラーゼ活性を示す図である。
ＧＲｋＳ－９７４細胞、ＧＲｋＳＢ－０４３細胞及びＧＲｋＳＢＺ－１８８細胞をＪｕｒｋａｔ細胞と共培養し、ＩＦＮγ刺激した際のルシフェラーゼ活性を示す図である。
ＧＲｋＳ－９７４細胞、ＧＲｋＳＢ－０４３細胞及びＧＲｋＳＢＺ－１８８細胞をＪｕｒｋａｔ細胞又はＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＮＬｕｃ細胞と共培養し、ＩＦＮγ刺激した際のルシフェラーゼ活性を示す図である。
ＧＲｋＳ－９７４細胞、ＧＲｋＳＢ－０４３細胞及びＧＲｋＳＢＺ－１８８細胞を抗ＣＤ３ε抗体の有無でＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＮＬｕｃ細胞と共培養した際のルシフェラーゼ活性を示す図である。
ＩＦＮγに応答してＧＲｋＳＢＺ－１８８細胞が樹状細胞様作用を有することを示す図である。
ＮＹ－ＥＳＯ－１ｃＤＮＡのトランスフェクト、ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドの付与の有無による、ＧＲｋ－２８１細胞とＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｎｌｕｃ／抗ＥＳＯ－２８ＢＢＺ細胞とを共培養した際のルシフェラーゼ活性を示す図である。下図は内在性のＩＦＮＡＲ１がノックアウトされていることを示している。
ＮＹ－ＥＳＯ－１ｃＤＮＡのトランスフェクト、ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドの付与の有無による、ＧＲｋｈ－１１７細胞とＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｎｌｕｃ／抗ＥＳＯ－２８ＢＢＺ細胞とを共培養した際のルシフェラーゼ活性を示す図である。下図は内在性のＩＦＮＡＲ１がノックアウトされていることを示している。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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