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公開番号2025012831
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-24
出願番号2023115958
出願日2023-07-14
発明の名称COVID-19重症度予測因子
出願人学校法人順天堂
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類G01N 33/573 20060101AFI20250117BHJP(測定;試験)
要約【課題】新たなCOVID-19重症度予測因子を見出し、COVID-19重症度予測方法及びCOVID-19重症度予測用試薬を提供すること。
【解決手段】uPA、uPA/PAI-1複合体及び非複合PAI-1から選ばれる1種以上の血中濃度を測定することを特徴とする、COVID-19患者の重症度予測の指標とする、測定方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ｕＰＡ、ｕＰＡ／ＰＡＩ－１複合体及び非複合ＰＡＩ－１から選ばれる１種以上の血中濃度を測定する方法であって、得られた前記血中濃度をＣＯＶＩＤ－１９患者の重症度予測の指標とする、測定方法。
続きを表示（約 330 文字）【請求項２】
前記重症度予測の指標が、ｕＰＡ、又はｕＰＡ／ＰＡＩ－１複合体の血中濃度が所定の基準値より低い場合に重症化する指標とし、非複合ＰＡＩ－１の血中濃度が所定の基準値より高い場合に重症化する指標とする、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
ｕＰＡ、ｕＰＡ／ＰＡＩ－１複合体及び非複合ＰＡＩ－１から選ばれる１種以上の血中濃度の測定試薬を含有する、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症度予測用試薬。
【請求項４】
ｕＰＡ、又はｕＰＡ／ＰＡＩ－１複合体の血中濃度が所定の基準値より低い場合に重症化すると予測し、非複合ＰＡＩ－１の血中濃度が所定の基準値より高い場合に重症化すると予測するプロトコールを含む、請求項３記載の重症度予測用試薬。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９重症度予測方法及びＣＯＶＩＤ－１９重症度予測用試薬に関する。
続きを表示（約 3,800 文字）【背景技術】
【０００２】
新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）患者においては、凝固線溶系異常を示す場合が多く、日本血栓止血学会は、２０２０年５月１３日付けで、新型コロナウイルス感染による血栓症発症リスク増大の警鐘と題する記事を、当該学会のウェブサイトに掲載した（非特許文献１）。この記事によると、凝固異常に伴う血栓症発症とＤＩＣがＣＯＶＩＤ－１９の予後因子であること、特に中等症及び重症患者では、臨床症状、Ｄ－ダイマー値、フィブリノゲン値、血小板数を考慮して抗凝固療法を実施することを推奨している。また、ＣＯＶＩＤ－１９患者において、バイオマーカーとしてプラスミノゲン活性化因子阻害剤－１（ＰＡＩ－１）及び組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）が提唱されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
日本血栓止血学会ウェブサイト（２０２０年５月１３日）
ＳｃｉＲｅｐ２０２１，１１，１５８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、多くのＣＯＶＩＤ－１９患者における重症度予測は困難であり、新たな重症度予測因子が求められている。
従って、本発明の課題は、新たなＣＯＶＩＤ－１９重症度予測因子を見出し、ＣＯＶＩＤ－１９重症度予測方法及びＣＯＶＩＤ－１９重症度予測用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者らは、日本における多くのＣＯＶＩＤ－１９患者を対象として、線溶系の重症度予測因子を見出すべく検討したところ、全く意外にも、重症化する患者においては、血中のウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）濃度、及びｕＰＡ／ＰＡＩ－１複合体濃度が低下し、非複合ＰＡＩ－１濃度が上昇すること、そしてこれらの濃度を測定すれば、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症度が予測できることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、次の［１］～［４］を提供するものである。
［１］ｕＰＡ、ｕＰＡ／ＰＡＩ－１複合体及び非複合ＰＡＩ－１から選ばれる１種以上の血中濃度を測定する方法であって、得られた前記血中濃度をＣＯＶＩＤ－１９患者の重症度予測の指標とする、測定方法。
［２］前記重症度予測の指標が、ｕＰＡ、又はｕＰＡ／ＰＡＩ－１複合体の血中濃度が所定の基準値より低い場合に重症化する指標とし、非複合ＰＡＩ－１の血中濃度が所定の基準値より高い場合に重症化する指標とする、［１］記載の測定方法。
［３］ｕＰＡ、ｕＰＡ／ＰＡＩ－１複合体及び非複合ＰＡＩ－１から選ばれる１種以上の血中濃度測定試薬を含有する、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症度予測用試薬。
［４］ｕＰＡ、又はｕＰＡ／ＰＡＩ－１複合体の血中濃度が所定の基準値より低い場合に重症化すると予測し、非複合ＰＡＩ－１の血中濃度が所定の基準値より高い場合に重症化すると予測するプロトコールを含む、［３］記載の重症度予測用試薬。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ＣＯＶＩＤ－１９患者が重症化するか否かが予測できるため、これらの因子が好転するように治療すれば重症化のリスクを低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
複雑相の日本人ＣＯＶＩＤ－１９患者におけるプラスミン／２－アンチプラスミンの増加を伴う線溶亢進を示す図である。（Ａ）ＥＬＩＳＡを用いた適応臨床期のＣＯＶＩＤ－１９患者のＤ－ダイマーのレベル、（Ｂ）血清ＣＯＶＩＤ－１９患者検体に等量の蛋白質を負荷後、イムノブロットでプラスミノゲン、（Ｃ）プラスミン／α２－アンチプラスミン複合体、（Ｄ）α２－アンチプラスミンのウエスタンブロット分析法。すべてのウエスタンブロット法を少なくとも２回実施し、同様の結果を得た。（Ｂ－Ｄ）信号強度を用いてバンド強度を定量化し、健常ドナーの１サンプルに正規化した。＊ｐ＜０．１；＊＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．０１；ｎ／ｓ－有意差なし。
循環血中の遊離ｕＰＡ、非複合ＰＡＩ－１およびｕＰＡ／ＰＡＩ－１複合体レベルは、重症のＣＯＶＩＤ－１９患者のＣＯＶＩＤ－１９患者で最も高いことを示す図である。（Ａ）ＰＡＩ－１官能基ＥＬＩＳＡ法を用いて、患者および健常ドナー血清中の活性を測定した。分子量４５ｋＤａの非複合体ＰＡＩ‐１抗原（Ｂ）、分子量７０ｋＤａのｔＰＡ（Ｃ）、及び分子量５０ｋＤａのｕＰＡ（Ｅ）の血清レベル評価にウエスタンブロット分析法を用いた。健常ドナー由来のサンプルに標準化したバンド強度の定量化を、１２０ｋＤａおよび１００ｋＤａのバンド（図３）として検出可能なｔＰＡ／ＰＡＩ－１（Ｄ）およびｕＰＡ／ＰＡＩ－１（Ｆ）複合体について行った。＊ｐ＜０．１；＊＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．０１；ｎ／ｓ；有意差なし。
図２の試験に用いたウエスタンブロットの結果を示す。
ＰＡｓ／ＰＡＩ－１対プラスミン／α２－アンチプラスミン（ｎ＝３６）相互関係の相関分析結果を示す。相関分析にはＳｐｅａｒｍａｎ係数ｒを用いた。
プラスミン活性と関係したＣＯＶＩＤ‐１９患者における内皮機能障害血清マーカーの変化血清可溶性ＶＣＡＭ‐１（ｓＶＡＣＭ）（Ａ）とｕＰＡＲ（Ｂ）をウエスタンブロット分析法を用いて測定し、健常ドナー由来のサンプルに標準化したバンド強度の定量を与えた結果を示す。ｎは各群で試験した患者数を示す。＊ｐ＜０．１；＊＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．０１；ｎ／ｓ；有意差なし。
血清ｓＶＣＡＭ１とｓｕＰＡＲのＰＡＩ－１活性（ｎ＝４５）と非複合ＰＡＩ－１抗原（ｎ＝３６）に対する相関分析の結果を示す。相関分析にはＳｐｅａｒｍａｎ係数ｒを用いた（Ｃ，Ｄ）。別のＳｐｅａｒｍａｎ相関性を、プラスミン／α２アンチプラスミン（Ｐｍ／α２ＡＰ）に対するｓＶＣＡＭ１とｓｕＰＡＲ（ｎ＝３６／群）（Ｅ，Ｆ）に対して行った結果も示す。ｎは各群で試験した患者数を示す。＊ｐ＜０．１；＊＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．０１；ｎ／ｓ；有意差なし。
ＣＯＶＩＤ－１９における炎症マーカーおよび炎症誘発性サイトカインＣＲＰ（Ａ）とＩＬ６（Ｂ）の抗原レベルをＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。また、血清ＩＬ１β（Ｃ）、ＴＧＦβ（Ｄ）、およびＴＮＦα（Ｅ）をウエスタンブロット分析法により検出し、健常ドナー由来のサンプルに標準化したバンド強度の定量を与えた結果を示す。（Ｆ）ｑＰＣＲで測定したＴＮＦα転写レベルの倍数変化発現は、同一試料におけるβ－アクチン発現を用いて正規化した。各サンプル実施した。ｎは各群の検査患者数を示す。＊ｐ＜０．１；＊＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．０１；ｎ／ｓ；有意差なし。
ＣＯＶＩＤ－１９患者における線溶系および炎症マーカーの相関性を示す。（Ａ）Ｓｐｅａｒｍａｎ相関係数のヒートマップ正の係数をもつ対は茶色、負の係数をもつ対は青色である。（Ｂ）各パラメータのＳｐｅａｒｍａｎの相関性に関連するＰ値。
ＣＯＶＩＤ－１９患者のＰｅａｒｓｏｎの相関係数バイオマーカーのヒートマップ相関係数を示す。ヒートマップは、カラーバーで示したオレンジ／青色の強度の変化で表され、これにより、緑色で示された変数は正であり、オレンジ色の変数は負の相関を示した。相関は各相関係数の９５％ＣＩと統計学的に有意（ｐ＜０．０５）であった。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９の重症度を予測する方法及び当該重症度予測用試薬に関するものである。
その一態様は、ｕＰＡ、ｕＰＡ／ＰＡＩ－１複合体及び非複合ＰＡＩ－１から選ばれる１種以上の血中濃度を測定する方法であって、得られた前記血中濃度をＣＯＶＩＤ－１９患者の重症度予測の指標とする、測定方法である。
また別の一態様は、ｕＰＡ、ｕＰＡ／ＰＡＩ－１複合体及び非複合ＰＡＩ－１から選ばれる１種以上の血中濃度測定試薬を含有する、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症度予測用試薬である。
【００１０】
ＣＯＶＩＤ－１９とは新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）感染症をいい、ＣＯＶＩＤ－１９患者は、ＰＣＲ検査又は抗原検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ２が検出された患者である。ＣＯＶＩＤ－１９患者の症状は、厚生労働省が公開しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の診療の手引で、軽症（肺炎の所見なし、酸素飽和度９６％以上）、中等症Ｉ（呼吸困難・肺炎の所見なし、酸素飽和度９３～９６％）、中等症ＩＩ（酸素投与必要、酸素飽和度９３％以下）、重症（集中治療室・人工呼吸器が必要）の４段階に区分されている。
本発明の重症度の予測とは、これらの症状の段階の予測をいい、例えば中等症Ｉ、中等症ＩＩ又は重症になる可能性が高いことを予測することであり、前記分類の重症とは異なる。
（【００１１】以降は省略されています）

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