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公開番号2024157922
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-08
出願番号2023072592
出願日2023-04-26
発明の名称耐酸性微生物を抽出するための検水の前処理方法
出願人三浦工業株式会社
代理人個人
主分類C12Q 1/24 20060101AFI20241031BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】クーリングタワーの循環冷却水から採取したレジオネラ属菌の死菌による汚染度の高い検水について、レジオネラ属菌の検査精度を高める。
【解決手段】検水をレジオネラ属菌が耐性を示すpH3.6に調整する。pH3.6を含む高pH領域において負極性の電荷を有しかつレジオネラ属菌が通過可能なグラスファイバー製のシリンジフイルターに対してpHを調整した上記検水を通過させ、検水中において正極性に帯電したレジオネラ属菌を静電引力によりシリンジフイルターに捕捉する。シリンジフイルターにpH4.2で電気伝導度が20μS/cmの緩衝液を通過させた後、レジオネラ属菌の等電点より高pHの緩衝液、例えばpH7で電気伝導度が20μS/cmの緩衝液をシリンジフイルターに通過させて通過液を確保する。この通過液を誘電泳動に適用し、それにより通過液から分離されたレジオネラ属菌を回収してリアルタイムPCR法により検査する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
誘電泳動を利用して検水に含まれる耐酸性微生物を抽出するために、前記検水を前処理するための方法であって、
前記耐酸性微生物が耐性を示す酸性領域に前記検水のｐＨを調整する工程１と、
工程１で調整した前記検水のｐＨ値を含む高ｐＨ領域において負極性の電荷を有しかつ前記耐酸性微生物が通過可能なろ過材に対し、工程１においてｐＨを調整した前記検水を通過させる工程２と、
工程２を経た前記ろ過材に対し、前記耐酸性微生物が耐性を示す酸性領域のｐＨでありかつ前記誘電泳動により前記耐酸性微生物を選択的に捕捉可能な電気伝導度を有する第１緩衝液を通過させる工程３と、
工程３を経た前記ろ過材に対して前記耐酸性微生物の等電点より高ｐＨでありかつ前記誘電泳動により前記耐酸性微生物を選択的に捕捉可能な電気伝導度を有する第２緩衝液を通過させ、通過液を確保する工程４と、
を含む耐酸性微生物を抽出するための検水の前処理方法。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
前記ろ過材がグラスファイバー若しくはグラスウールまたはこれらの混合繊維を用いて形成されている、請求項１に記載の検水の前処理方法。
【請求項３】
第２緩衝液としてタンパク質、糖類、界面活性剤またはアルコール類を添加したものを用いる、請求項１または２に記載の検水の前処理方法。
【請求項４】
工程３と工程４との間において、前記耐酸性微生物の耐熱条件下で前記ろ過材を加熱する、請求項１または２に記載の検水の前処理方法。
【請求項５】
工程２の前に前記ろ過材を第２緩衝液により処理する、請求項１または２に記載の検水の前処理方法。
【請求項６】
前記耐酸性微生物が細菌、カビまたは酵母である、請求項１または２に記載の検水の前処理方法。
【請求項７】
検水に含まれる耐酸性微生物を抽出するための方法であって、
前記耐酸性微生物が耐性を示す酸性領域に前記検水のｐＨを調整する工程１と、
工程１で調整した前記検水のｐＨ値を含む高ｐＨ領域において負極性の電荷を有しかつ前記耐酸性微生物が通過可能なろ過材に対し、工程１においてｐＨを調整した前記検水を通過させる工程２と、
工程２を経た前記ろ過材に対し、前記耐酸性微生物が耐性を示す酸性領域のｐＨである第１緩衝液を通過させる工程３と、
工程３を経た前記ろ過材に対して前記耐酸性微生物の等電点より高ｐＨである第２緩衝液を通過させ、通過液を確保する工程４と、
工程４において確保した前記通過液を誘電泳動に適用する工程５と、
を含み、
第１緩衝液および第２緩衝液として、前記誘電泳動により前記耐酸性微生物を選択的に捕捉可能な電気伝導度を有するものを用いる、
耐酸性微生物の抽出方法。
【請求項８】
検水に含まれる耐酸性微生物の検査方法であって、
前記耐酸性微生物が耐性を示す酸性領域に前記検水のｐＨを調整する工程１と、
工程１で調整した前記検水のｐＨ値を含む高ｐＨ領域において負極性の電荷を有しかつ前記耐酸性微生物が通過可能なろ過材に対し、工程１においてｐＨを調整した前記検水を通過させる工程２と、
工程２を経た前記ろ過材に対し、前記耐酸性微生物が耐性を示す酸性領域のｐＨである第１緩衝液を通過させる工程３と、
工程３を経た前記ろ過材に対して前記耐酸性微生物の等電点より高ｐＨである第２緩衝液を通過させ、通過液を確保する工程４と、
工程４において確保した前記通過液を誘電泳動に適用する工程５と、
前記誘電泳動により前記通過液から分離された前記耐酸性微生物を回収する工程６と、
回収した前記耐酸性微生物を検査する工程７と、
を含み、
第１緩衝液および第２緩衝液として、前記誘電泳動により前記耐酸性微生物を選択的に捕捉可能な電気伝導度を有するものを用いる、
耐酸性微生物の検査方法。
【請求項９】
工程７は、
回収した前記耐酸性微生物から核酸を抽出する工程７Ａと、
抽出された前記核酸を核酸増幅法により検査する工程７Ｂと、
を含む、請求項８に記載の耐酸性微生物の検査方法。
【請求項１０】
工程７Ａの前に、回収した前記耐酸性微生物に対して選択的細胞膜透過性色素による処理をする工程７Ｃをさらに含む、請求項９に記載の耐酸性微生物の検査方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、検水の前処理方法、特に、誘電泳動を利用して検水に含まれる耐酸性微生物を抽出するために、検水を前処理するための方法に関する。なお、耐酸性微生物は、特に断りのない限り、耐酸性微生物の生体（例えば、耐酸性微生物が細菌の場合は生菌。）を意味する。
続きを表示（約 3,200 文字）【背景技術】
【０００２】
飲用水や浴槽水などの生活用水は、水源や環境などの諸要因により種々の微生物を微量に含むことがあり、その含有量が一定量を超えると感染症等を誘発するおそれがある。例えば、公衆浴場や宿泊施設での循環式の温泉水や浴槽水、或いは、クーリングタワーの循環冷却水において屡々検出されるレジオネラ属菌は、耐酸性微生物であってポンティアック熱や重篤な肺炎（レジオネラ肺炎）等の疾病の原因となる病原菌である。そこで、温泉水等の浴槽水については、条例によりレジオネラ属菌の規制値が１０ＣＦＵ／１００ｍＬ未満と規定されるとともに、年に一度のレジオネラ属菌の検査が義務付けられており、また、クーリングタワーの循環冷却水については、別途１００ＣＦＵ／１００ｍＬ未満の推奨値が設けられるとともに同様の検査が推奨されている。
【０００３】
浴槽水や循環冷却水に含まれるレジオネラ属菌が規制値を超えるか否かを判定するための検査方法として、非特許文献１、２は、培養法を規定している。培養法では、浴槽水等から採取した検水を濃縮した後に夾雑菌の殺菌処理をすることで検査用試料を調製する。そして、検査用試料の一定量を選択培地に塗布して５～７日間培養し、湿潤性の青白および灰白の集落が出現した場合は検水に規制値以上のレジオネラ属菌が含まれるものと仮に判断し、確認試験を実施する。確認試験では、選択培地に出現した集落をＬ－システイン不含培地およびＢＣＹＥα培地に塗布して２～７日間さらに培養する。これでＢＣＹＥα培地のみに集落が形成された場合、検水に規制値以上のレジオネラ属菌が含まれるものと最終判断する。
【０００４】
培養法は、培養に日数を要することから、検水の採取から結果の判定までに少なくとも１０日前後の長期間を要し、この点が浴槽水や循環冷却水等の水質管理上の難点である。そこで、非特許文献１は、浴槽水が水質基準に適合しているか否かを判断するための検査方法として、レジオネラ属菌の生菌の核酸を定量的に検出可能な迅速検査法であるＬＣＥＭＡ－ｑＰＣＲ法（非特許文献３、４）を認めている。ＬＣＥＭＡ－ｑＰＣＲ法では、検水をろ過濃縮後に酸処理することで検水中の夾雑微生物の生息を抑制し、レジオネラ属菌を選択的に増殖するための液体培養（ＬｉｑｕｉｄＣｕｌｔｕｒｅ（ＬＣ））を開始する。続いて、液体培養された試料に対して選択的膜透過性色素であるエチジウムモノアジド（ＥＭＡ）を添加するとともに光照射し、それによって生息を抑制された夾雑微生物およびレジオネラ属菌の死骸に由来の核酸をＥＭＡにより修飾した後、この試料に対して迅速検査法であるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（ｑＰＣＲ法）を適用する。このｑＰＣＲ法においては、生息を抑制された夾雑微生物およびレジオネラ属菌の死骸の両者に由来の核酸がＥＭＡにより修飾されることでポリメラーゼ連鎖反応の鋳型とならないことから、レジオネラ属菌の生菌に由来の核酸が選択的に増幅し、当該生菌に由来の核酸を選択的に検出することができる。ＬＣＥＭＡ－ｑＰＣＲ法によれば、浴槽水についてレジオネラ属菌に係る水質基準の適合・不適合を培養法よりも大幅に短縮された２日で判定可能とされている。
【０００５】
しかし、ＬＣＥＭＡ－ｑＰＣＲ法は夾雑微生物等による汚れの比較的少ない浴槽水を検査対象とするものであり、夾雑微生物等、特に、レジオネラ属菌の死菌による汚染度の高い循環冷却水が検査対象の場合は検査精度が低下する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
令和元年９月１９日厚生労働省医薬・生活衛生局生活衛生課長通知「公衆浴場における浴槽水等のレジオネラ属菌検査方法について」
日本工業規格ＪＩＳＫ０３５０－５０－１０：２００６、「工業用水・工場排水中のレジオネラ試験方法」
タカラバイオ株式会社、レジオネラ属菌検査生菌検出法（LC EMA-qPCR法）［検索日２０２３．０４．２５］、インターネット＜URL：https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100007673＞
タカラバイオ株式会社、Viable Bacteria Selectionシステムによる生菌由来DNAの選択的検出（EMA-PCR法）［検索日２０２３．０４．２５］、インターネット＜URL：https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100006890#ema-pcr＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、夾雑微生物等による汚染度の高い検水、特に、耐酸性微生物の死骸による汚染度の高い検水に含まれる耐酸性微生物の検査精度を高めることができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、誘電泳動を利用して検水に含まれる耐酸性微生物を抽出するために、検水を前処理するための方法に関するものである。この前処理方法は、耐酸性微生物が耐性を示す酸性領域に検水のｐＨを調整する工程１と、工程１で調整した検水のｐＨ値を含む高ｐＨ領域において負極性の電荷を有しかつ耐酸性微生物が通過可能なろ過材に対し、工程１においてｐＨを調整した検水を通過させる工程２と、工程２を経たろ過材に対し、耐酸性微生物が耐性を示す酸性領域のｐＨでありかつ誘電泳動により耐酸性微生物を選択的に捕捉可能な電気伝導度を有する第１緩衝液を通過させる工程３と、工程３を経たろ過材に対して耐酸性微生物の等電点より高ｐＨでありかつ誘電泳動により耐酸性微生物を選択的に捕捉可能な電気伝導度を有する第２緩衝液を通過させ、通過液を確保する工程４と、を含む。
【０００９】
工程１においてｐＨが調整された検水において、耐酸性微生物は正極性の電荷を有する状態で安定に生息するのに対し、耐酸性微生物以外の夾雑微生物は検水の酸性環境において生息を抑制される。工程２において、工程１を経た検水をろ過材に通過させると、ろ過材は負極性に帯電し、検水中において正極性に帯電する耐酸性微生物を静電引力により引き付けて捕捉する。一方、検水において生息を抑制された夾雑微生物は、検水とともにろ過材を通過する。そして、工程３においてろ過材に対して第１緩衝液を通過させると、耐酸性微生物はろ過材に保持され続ける一方でろ過材に残留する検水が第１緩衝液により置換され、また、工程４においてろ過材に対して第２緩衝液を通過させると、第２緩衝液のｐＨ環境により耐酸性微生物は負極性の電荷を得ることから負極性に帯電するろ過材に対して反発し、ろ過材から離脱して第２緩衝液へ移行する。したがって、工程４においてろ過材を通過した第２緩衝液による通過液を確保すると、耐酸性微生物を含む前処理液が得られる。この前処理液は、第１緩衝液および第２緩衝液のいずれもが誘電泳動により耐酸性微生物を選択的に捕捉可能な電気伝導度を有することから、そのまま誘電泳動に適用することができ、誘電泳動に適用すると耐酸性微生物が捕捉される。
【００１０】
本発明に係る前処理方法において、ろ過材は、例えば、グラスファイバー若しくはグラスウールまたはこれらの混合繊維を用いて形成されている。
（【００１１】以降は省略されています）

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